人工血管管壁涂层生物材料的生物相容性评价

作者：王康，史宏灿，陆世春，孙超，贺建胜，裴昶

【摘要】 对人工血管管壁涂层的生物材料进行生物相容性的实验评价。按照国际标准，对相关单个和混合材料进行急性全身毒性试验、热源试验、溶血试验和细胞毒性试验。 结果表明：本实验涉及的生物材料胶原蛋白、聚乳酸以及混合组分材料均符合生物相容性评价实验的安全标准。说明胶原蛋白和聚乳酸作为复合型人工血管管壁涂层材料具有生物相容性和安全性，可为临床产品的研制提供依据。

【关键词】 人工血管涂层材料；生物材料；生物相容性；胶原蛋白；聚乳酸

Abstract：To make evaluation far biocompatibility of the materials which is covered on the vascular prosthesis surface.With the international standardizations， some experiments for the materials were done， include acute systemic toxicity test ， pyrogen test ，hemolysis test and cytotoxicity test.Results showed that the collagen protein，L-polylactic acid and the mixed materials were all consistent with the safety control.It proves that the collagen protein and L-polylactic acid are with biocompatibiliy and safety for coating on the surface of vascular prosthesis.

Key words：Converage of vascular prosthesis; Biomaterial; Biocompatibility;Collagen protein; L-polylactic acid

1 引 言

人工血管主要与血液接触，因此生物材料的血液相容性是最关键的问题。另外，蛋白质［1］、粒-单系细胞［2］、补体和细胞因子［3］等对于生物材料的相容性也有一定程度的影响。表面特性对于接触血液形成血栓的影响最为关键，例如外形、表面粗糙程度、可湿性、亲水性等［4］。此外，血液的流态影响也是血栓形成的一个方面。寻找两个方面彼此适应的契合点被认为是最好的解决方法。因此，表面涂层技术被运用于改善人工血管的生物相容性。将材料表面覆盖上一层其他生物相容性好的物质，将材料与体液环境分隔开，避免接触，从而达到减少甚至避免排斥反应。

2 试验方法

试验所有标准均符合《医疗器械生物学评价》GB/T 16886.1—1997国家标准相关规定。胶原蛋白由黑龙江卫世医药有限公司提供，L聚乳酸由济南健宝开元生物材料有限公司提供。混合材料制备方法：将液状胶原蛋白与聚乳酸等体积混合，充分均匀搅拌，置4℃冰箱中凝固成固体状备用。

2.1 急性全身毒性试验

2.1.1 试验原理 将试验材料或材料浸提液通过动物静脉或腹腔注射到动物体内，观察动物的生物学反应，以判定材料的急性毒性作用。

2.1.2 材料浸提液 将受试材料制成20 mm×10 mm、厚1 mm的立方体长条薄片。按照浸提介质：试样表面积=1 m1：3 cm2制成，浸提介质为0.9%生理盐水，浸提条件为37℃，72 h。0.22 um的微孔滤器灭菌，4℃冰箱保存备用。阴性对照采用0.9%生理盐水。

2.1.3 实验动物 选取体重20～27 g的健康昆明系小鼠，雌雄分笼同养，分六个实验组，每组5只。

2.1.4 实验方法 （1）浸提液及阴性对照液，置于37℃恒温水浴箱中复温。（2）将浸提液以及对照液按50 ml/kg剂量由小鼠尾静脉缓慢注入。

2.1.5 评价方法 记录注射后实验动物在24 h， 48 h， 72 h的体重变化，观察其一般状态、毒性表现及死亡情况。材料毒性程度根据中毒症状分为无毒、轻度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡。所有数据均采用SPSS10.0统计学处理系统软件进行数据分析，统计学处理采用t检验。

2.2 热源试验

2.2.1 试验原理 将材料浸提液由耳缘静脉注入家兔体内，在规定时间内观察家兔体温升高情况，以判断浸提液中所含热源的限度是否符合规定。

2.2.2 材料浸提液 将材料制成10 mm×20 mm、厚1 mm方形薄片。按浸提介质：试样表面积=lml：3 cm2制成，浸提介质为0.9%生理盐水，浸提条件为37℃，72 h。0.22 um的微孔滤器灭菌。阴性对照采用0.9%生理盐水。

2.2.3 实验动物 健康新西兰大白兔，2.3～2.8 kg，雌雄不限，3只为一实验组。

2.2.4 实验方法 (1)将肛门体温计插入家兔肛门，深度约6 cm，时间约3 min；试验前禁食2 h，间隔30 min分别测3次体温，取其平均值为正常体温值。(2)材料浸提液37℃恒温箱预热后，沿耳缘静脉缓慢注入，剂量为10 ml/kg。(3)注射后每隔l h测量1次，共测3次，以3次中体温最高值减去正常体温，即为体温升高度数。

2.2.5 评价标准 如果每一实验组体温升高均在0.6℃以下，且体温升高总数在1.4℃以下，可认为试验材料浸提液符合热源检查要求；如每一实验组中体温升高≥0.6℃的动物数超过1只，或在复试的3只兔中，体温升高≥0.6℃动物数仍有1只或以上；或初、复试体温升高总数超过3.5℃，则认为材料浸提液不符合热源检查要求。

2.3 溶血试验

2.3.1 试验原理 通过试样材料或其浸提液在体外与动物血液直接接触，根据测定红细胞释放的血红蛋白量来评价该材料是否对红细胞的功能和代谢造成不良影响，对材料是否具有溶血反应进行客观评价。

2.3.2 实验动物及材料 健康新西兰兔1只，体重2.57 kg。阴性对照采用0.9%生理盐水，阳性对照采用蒸馏水。

2.3.3 实验方法 (1) 将试样材料制成2.5 cm×2 cm小条状，置于生理盐水40 ml中，置37℃恒温水浴箱中保温30 min。（2）试样组、阳性、阴性对照组各设平行样品试管5个，每管加相应浸提液4 ml。(3) 将肝素一支（12 500U）溶于50 ml生理盐水中，使用时按照1 ml血配25U肝素的比例使用。（4）心脏采兔血20 m1，加入2%肝素1 ml，制成新鲜抗凝血，然后按新鲜抗凝血：生理盐水=4：5的比例制成稀释兔血。(5) 每试管加稀释兔血0.2 m1，混匀，37℃恒温水浴箱保温60 min。（6）所有试管经1 500 rpm，离心5 min，取上清在545 nm波长测其吸光度。

2.3.4 评价方法 溶血率(%)=(试样组吸光度一阴性组吸光度)/(阳性组吸光度一阴性组吸光度)×100%。评判标准：阴性对照管吸光度＜0.03，阳性对照管吸光度为0.8±0.30时实验结果有效，当溶血率≤5%时，可判断该材料不具溶血作用。

2.4 细胞毒性试验

2.4.1 试验原理 利用细胞体外培养的方法来评价医用材料及装置或其浸提液可滤出成分中潜在性的细胞毒性。

2.4.2 实验方法 (1)细胞形态观察法 将不同受试材料以及阳性、阴性参照材料分别置于培养皿内，然后加入5×104/ml的L-929细胞悬液3 m1于培养皿内，每组设平行样品5个，加入新鲜培养液，放入37℃，5%CO2培养箱内培养。培养过程中定时通过倒置显微镜观察受试材料表面及边缘的细胞，根据其形态和生长状况把毒性分级分为无毒，轻度、中度、重度毒性。

(2)MTT比色法 取96孔培养板，加入5×104/ml L-929细胞悬液100 u1/孔，开放培养。24 h后，每孔加入试样浸提液100 ul，空白对照组加入100 ul新鲜培养液。置37℃，5%CO2培养箱内分别连续培养2 d、4 d和7 d。观察时，每孔加入MTT (5mg/ml) 50 u1，继续培养至6 h后，弃原培养液，加入DMSO 150u1/孔，室温轻度振荡15 min。使用酶联免疫测定仪测试其吸光度值。测试波长为490 nm，参考波长为550 nm。计算细胞相对增值率(relative growth rate，RGR)=实验组吸光度均值/空白对照组吸光度均值)×100%。然后根据6级毒性评分标准转换成毒性分级(0-5级)：大于100%为0级，75%～99%为1级，50%～74%为2级，25%～49%为3级，1%～24%为4级，0为5级。

3 试验结果

3.1 急性全身毒性试验

所有实验小鼠均无死亡，活动、进食及大小便均正常，精神状态良好，无惊厥、抽搐、瘫痪、呼吸抑制等毒性反应。不同观察时间内动物体重均有一定程度的增加，但是在正常范围之内（见表1）。结果阴性对照组比较未见明显差异(P＞0.05)，表明两种受试材料均属无毒级生物材料。表1 急性全身毒性试验小鼠体重增加结果

3.2 热源试验

结果见表2。各试验组动物注射材料浸提液后，体温升高均在0.6℃以下，且温度升高总数在1.4℃以下，符合热源检测有关规定，表明受试材料及其浸提液不含致热源物质，材料植入体内后无热源作用。表2 人工血管涂层材料试样热源试验结果

3.3 溶血试验

结果见表3。本实验中，试样管离心后上层均为清亮无色液体，下层为红细胞沉淀物，涂片镜检未见红细胞破裂或凝聚。阴性对照管的吸光度小于0.03，阳性对照管吸光度在0.8±0.3范围内，符合国家标准。根据非直接接触血液的医用生物材料性能测试所提出的溶血率小于5%标准，判定两种受试材料体外试验不引起溶血反应。 表3 人工血管涂层材料试样溶血试验结果

3.4 细胞毒性试验

3.4.1 细胞形态观察 见图1、图2、图3、图4、图5。

3.4.2 MTT法 试样材料MTT法检测结果见表4、表5、表6。表4 MTT法培养2天的试验结果表5 MTT法培养4天的试验结果 表6 MTT法培养7天的试验结果

4 讨论

急性全身毒性试验是一种非特异性急性毒性试验。本实验采用小鼠腹腔注射途径，结果显示，72 h内所有实验组小鼠均无死亡，活动正常，精神状态良好，没有毒性反应。与阴性对照组比较没有明显差异（P＞0.05 )，表明两种材料均属无毒级的生物材料，而且材料混合后也没有产生另外的毒性物质，符合生物材料的安全性标准。

生物材料在制备过程中可能残留的单体、辅助添加剂或被内毒素污染等都会含有致热源物质，在植入体内后会引起恒温动物体温的异常上升。热源试验［5］过程中应该尽量杜绝室温，注射液温度，惊吓等影响因素对实验结果的干扰。本实验结果表明，两种材料均不含致热源物质；并且组份材料混合后也未产生新的致热源物质。

溶血试验［6］可以作为体外细胞毒性试验的一个重要补充。如果材料有溶血作用，则提示材料可能具有细胞毒性。实验结果表明，阴性对照管的吸光度小于0.03，阳性对照管吸光度在0.8士0.3范围内，符合国家标准。两种材料溶血率分别为0.20%、0.18%，混合材料组的溶血率为0.15%，均符合医用生物材料的应用要求。可以认为这两种材料没有溶血作用。

细胞毒性是指利用生物材料及其浸提液与细胞进行体外培养的方法来评价医用材料及装置或其浸提液可滤出成分中潜在性的细胞毒性。目前，几乎所有的生物材料都必须通过相关试验检测其是否具有细胞毒性。聚全氟乙丙烯是已知并通过实验论证的无毒聚合材料，已经被广泛应用于医疗用品的生产制备，本实验作为阴性对照材料；聚氯乙烯则为已知有毒材料，本实验用作阳性对照材料。从图1～5可以看出，两种材料以及混合材料组的细胞形态均正常，贴壁生长良好，与阴性对照组无明显差别；而阳性对照组中大部分细胞变成圆形，胞核固缩，凋亡细胞明显增多，材料表面细胞稀少，基本不贴壁。根据已知的细胞形态分析标准，人工血管两种涂层材料均不具备细胞毒性。

MTT比色法的生物学终点是线粒体活性的检测。细胞生命活动旺盛时，线粒体数量就增多，衰退时则减少。本实验中我们发现，聚乳酸组L-929细胞在体外共同培育时，2 d、4 d时细胞毒性均为1级，RGR分别为88.61%和95.7%，而在7 d时细胞毒性评级［7-8］就转评为0级，并且RGR处于逐渐升高状态，这种现象可能与随着培养时间的延长，轻度受损后的细胞其活力得到一定的恢复有关。胶原蛋白、混合材料和聚全氟乙丙烯与L-929细胞在体外共同培育时，细胞毒性评级一直处于0级水平。阳性对照组的细胞RGR在培育期间呈逐渐下降趋势，其细胞毒性分级在2 d时为1级，而在4 d为2级，7 d时则增加到3级。试验结果表明，两种受试材料表现出了良好的细胞相容性。

5 结论及展望

随着心脏血管外科技术的成熟与发展，处理好生物材料在体内生物相容性的问题，会对新材料的研制和开发产生重要的影响。