关于乳鼠心成纤维细胞波形蛋白和线粒体表达的激光扫描共聚焦显微镜观察

作者：王春梅郭海涛杨家冀黄晓峰陈丹朱妙章

【关键词】 成纤维细胞 关键词: 成纤维细胞;细胞骨架;线粒体;激光扫描共聚焦显微镜;大鼠 摘 要:目的 用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察培养的乳鼠心成纤维细胞中细胞骨架波形蛋白（vimentun，Vim）、线粒体（mitochondrial，Mi）以及相互关系. 方法 分离纯化乳鼠心成纤维细胞，免疫荧光双标记技术进行了Vim和Mi的标记，激光扫描共聚焦显微镜观察. 结果 培养的乳鼠心成纤维细胞中Vim位于细胞的胞质中，呈粗细不等的绿色线条状或丝状分布，标记明显，许多细丝交织形成网状结构.Mi标记为红色颗粒状，遍布于细胞质中，Mi的颗粒大小不等，形态不一，可聚集成团，并有明显的沿着Vim分布的趋势. 结论 LSCM观察培养的心成纤维细胞中Vim呈细丝交织形成立体的网状结构，Mi有沿着细胞骨架Vim分布的趋势. Keywords:fibroblasts;cytoskeleton;mitochondrion;laser scanning confocal microscope;rats Abstract:AIM To observe the vimentin（Vim），mitochon-drion（Mi）and their interrelationships in the cultured cardiac fibroblast of rat with laser scanning confocal microscope.METHODS The cardiac fibroblasts of rat underwent double labeling of Vim and Mi by immunofluorescence technique after isolation and purification，then were observed with laserscanning confocal microscope.RESULTS Vim was observed in the cytoplasm of cardiac fibroblast of rat clearly，with a distribution of irregular green lines or fila.Most of them dis-played reticular formation.Mi were the red granules，which were universally distributed in the cytoplasm.The size and shape were irregular，either gathered in a mass or distributed along Vim.CONCLUSION Laser scanning confocal micro-scopic observation reveals that Vim is filament-like and can display reticular formation and Mi might be distributed along Vim. 0 引言 激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）已广泛应用于生物医学的各个领域［1，2］ .但是对于心成纤维细胞中细胞骨架观察未见报道.了解心成纤维细胞增殖和功能的变化特征，尤其是细胞骨架的分布与变化及与能量供给单位-线粒体的关系，对采取及时的防治措施是十分重要的［3］ .我们采用免疫荧光双标记技术对培养的心成纤维细胞进行了波形蛋白（vimentun，Vim）和线粒体（mitochondrial，Mi）的标记，用激光扫描共聚焦显微镜观察了形态和分布以及相互的关系.旨在探讨正常培养的心成纤维细胞中Vim和Mi的定性、定位，以及相互的关系，为进一步研究心成纤维细胞的病理变化提供实验依据. 1 材料和方法 1.1 材料 SD乳鼠（1～2d）:由第四军医大学实验动物中心提供.胰酶:Difco，胶原酶:EDTA，DMEM培养基及小牛血清:Gibco;线粒体标记物Mito-Tracker（Gene Co Ltd1∶10000），波形蛋白标记物（Dako Vimentun1∶50），羊抗小鼠IgG-FITC. 1.2 方法 心成纤维细胞培养与鉴定与郭海涛等［4］ 方法相同.将载有心成纤维细胞的盖玻片pH7.4的PBS（37℃）冲洗1～2min3次，加入MitoTracker（37℃）15～45min，pH7.4的PBS冲洗3次，用4℃丙酮固定10～15min.pH7.4的PBS冲洗3次，加鼠抗波形蛋白45～60min37℃或4℃过夜.pH7.4的PBS洗3次，加FITC标记的羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物工程公司，稀释度1∶50）37℃孵育45～60min或4℃过夜.pH7.4的PBS洗3次，无荧光缓冲甘油封片.对照用无关抗体以及正常兔血清取代一抗染色作为抗体特异性对照，用PBS替代一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照.所用LSCM型号为Bio-Rad MRC-1024，用于FITC的激发波长为488nm，568nm用于激发Mi.用于图像采集的显微镜物镜为Plan-Neofluar40×油浸镜，数值孔径（NA）为1.3.图像存为512×512相素类型.ZOOM设为1.0.若需要更大的放大倍数时，可以选择更大的ZOOM范围.扫描所用的激发值依据样本的不同可以在共聚焦系统提供的梯级值中选择. 2 结果 2.1 心成纤维细胞波形蛋白 呈粗细不等的绿色线条状或丝状分布，标记明显，位于细胞的胞质中，单个细胞的许多细丝交织形成网状结构（Fig1）. 2.2 心成纤维细胞线粒体 标记为红色颗粒状，遍布于细胞质中，线粒体的颗粒大小不等，形态不一，可聚集成团（Fig2）.