PCNA与AgNoRs在鼻咽癌组织中表达的定量分析

【关键词】 鼻咽肿瘤

关键词: 鼻咽肿瘤;预后;增殖细胞核抗原;AgNoRs

1 材料和方法

1.1 材料 选取南方医院耳鼻咽喉科1980/1993鼻咽部活检组织的存档蜡块共计100例.病理诊断为鼻咽粘膜炎症22例，鼻咽癌78例，其中病理分化Ⅰ级者19例，分化Ⅱ级者20例，分化Ⅲ级者20例，泡状核细胞癌19例.

1.2 方法 免疫组化染色采用LAS-SP方法，第1抗体为鼠抗人PCNA单克隆抗体PC10（美国ZYMED公司产品），工作液稀释度1∶200;第2，第3抗体采用MOSP Kit试剂盒（美国ZYMED公司产品），工作液均稀释为1∶300.每例染片3张，包括阴性对照，PCNA染色并进行苏木精染色，复染结果用于计数增殖指数.AgNoRs染色选用高进介绍的一步法［1，2］ .PCNA染色结果判定是选择切片中最有代表性的视野.多例计数1000个癌细胞中PCNA的阳性细胞核数，按下列合成计算增殖指数（PI）:增殖指数（PI）=（阳性细胞数/1000）×100%.炎症粘膜中不计数炎性细胞和淋巴结反应中心细胞的阳性核数.PI≤0.05者视为阴性，在本研究中只对PI>0.05者进行讨论.AgNoRs染色后，应用LUZEX-F型图像分析系统，40倍镜下测定并打印100个癌细胞核内所含的AgNoRs总数，不同大小直径的颗粒数（C≥2.5μm按5个颗粒换算），颗粒总面积（AgNoRs总面积/100核）的值.

2 结果

2.1 细胞增殖指数（PI）、AgNoRs计数、图像分析结果 根据NPC病理改变将NPC病例分为5个组，PI，AgNoRs计数、图像分析结果各组有差异（表1）.

表1 炎症鼻咽粘膜与NPC各型PI，AgNoRs计数、图像分析结果 （略）

统计结果显示，病理分化Ⅰ级者、分化Ⅱ级者与分化Ⅲ级者各组之间PI差异有显著性，即随病理上恶性度的增高，PI亦增大.但泡状核细胞癌与病理分化Ⅲ级者之间无差别，病理上其恶性度与分化Ⅲ级者之间也很相近.

2.2 NPC组织中PCNA阳性细胞的分布情况 PCNA呈棕褐色的阳性反应，绝大多数PCNA阳性染色定位于细胞核，呈棕褐色颗粒或弥漫性分布，胞质几乎无表达，粘膜炎症及阴性对照无表达.鼻咽癌分化Ⅰ级者阳性细胞散在分布，棕色颗粒较均匀地分布于细胞核内，但染色较浅;分化Ⅱ级者阳性细胞数目较多，染色较深，棕色颗粒在核内分布也较均匀;分化Ⅲ级者阳性细胞数目多，分布密集，染色深;泡状核细胞癌阳性细胞表达较多，但着色浅，棕色颗粒在核内呈网状分布.

2.3 PI指数与鼻咽癌预后的关系 我们将每位患者（均行放射治疗）追踪随访资料整理分析，其中有46例随访到5a，通过寿命表法计算出5a生存率，病理分化Ⅰ级者为75%，分化Ⅱ级者为73%，分化Ⅲ级者为61%，泡状核细胞癌组为65%.统计结果显示，细胞增殖指数与5a生存率呈负相关，即细胞增殖指数高，5a生存率则降低（P<0.01）.

2.4 AgNoRs染色图像分布情况 鼻咽部炎症粘膜组织的AgNoRs形态可见核仁区个别AgNoRs团块，细胞核中银染颗粒分布少而且直径很小;鳞癌细胞核AgNoRs颗粒甚为丰富，散在于核内，大小不等形状不规则，有的甚至形成聚集区，多以核仁型和弥散型为主，随细胞分化程度的逐步降低，胞内AgNoRs颗粒≥2.5μm的逐步增多;泡状核细胞癌呈弥散分布，且表达量较鳞癌相对较少.随统计结果可以看出，Ag-NoRs计数与总面积随分化的增高而减少. 2.5 AgNoRs颗粒计数结果与NPC预后关系 分析Ag-NoRs计数与NPC预后关系随访资料，其中有40例记录到5a，包括目前患者状况，计算5a生存率，病理分化Ⅰ级者72%，分化Ⅱ级者69%，分化Ⅲ级者为60%，泡状核细胞癌组为63%.统计结果显示，AgNoRs计数与总面积与5a生存率呈负相关，即AgNoRs计数越大，5a生存率越低（P<0.01）.

上述结果表明NPC中PCNA的表达与AgNoRs计数在判定NPC的分化程度与预后方面存在明显相关性.

3 讨论

PCNA又称周期素，是一种30ku酸性无组蛋白的细胞核多肽，其免疫反应多局限于增殖细胞的核内，胞质很少或没有，已被证明它的合成与增殖细胞的增殖周期有关，G期在核内表达逐渐增多，S期达高峰，而G/M期很少

［3，4］ .本研究亦证实PCNA几乎只表达于NPC的细胞核内，且不是所有的癌细胞均表达，从增殖指数的统计结果可以看出，其表达率与病理分级呈正相关，即病理上恶性度越高，则PCNA表达的阳性细胞数量越多.AgNoRs作为调节rDNA转录活动的蛋白，其计数增加与细胞增殖活跃、DNA倍体增加及rDNA转录活性有关［5，6］ .多数作者认为，AgNoRs计数的主要临床意义在于区分良、恶性病变，而我们的结果表明AgNoRs计数对于区分NPC病理恶性度有统计学的相关性.对于泡状核细胞癌的PCNA表达与AgNoRs计数与未分化癌的不一致，可能与其病理形态有关，因其核的大部分呈空泡状，无实质之故，不过在临床预后上，许多病例已说明，泡状核细胞癌预后都要较未分化癌好，从侧面说明泡状核细胞癌恶性度要较未分化癌弱.本实验表明:NPC的PCNA表达、AgNoRs染色图像分析的结果与NPC的分化及预后有明显的相关性，这在PI与图像分析后的AgNoRs计数和AgNoRs总面积在NPC的组织分型，分化程度以及预后等方面都得到证实.二者不仅可用于NPC恶性度的判别，而且对NPC的预后亦有提示作用.

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