小鼠肾发育中Calbindin-D28k的定量分析

【摘要】 目的 观察Calbindin-D28k在小鼠肾发生发育中的表达规律。方法 应用蛋白印迹技术对各组小鼠肾Calbindin-D28k的表达进行定量检测。结果 胚龄12 d Calbindin-D28k表达量极低；胚龄14 d到胚龄16 d表达量增加；胚龄16 d到胚龄18 d表达量无显著性变化；胚龄18 d到生后7 d表达量明显增加；生后7 d到生后14 d，Calbindin-D28k表达量减少。生后14 d到生后40 d，Calbindin-D28k表达量无显著性差异。结论 从胚龄12 d到生后7 d期间Calbindin-D28k表达的逐渐增强与小鼠肾钙离子转运能力的完善可能有一定的关系。

【关键词】 Calbindin-D28k 小鼠 肾发育

Abstract：Objective To observe the expression rules of Calbindin-D28k during renal development of mouse. Methods Western blotting technique was used to measure the protein content of Calbindin-D28k at different development stages of embryonic and postnatal mice. Results At E12， Calbindin-D28k expression could be hardly detected in the kidney. From E14 to E16， the expression was increased. There was no significant difference from E16 to E18. From E18 to N7， the expression of Calbindin-D28k was increased obviously. From N7 to N14， the expression of Calbindin-D28k was decreased. There was no significant difference between N14 and 40. Conclusions The expression of Calbindin-D28k is weak at E12， and is enhanced with ages to the peak at N7， and decreased thereafter. Calbindin-D28k is a calcium ferry protein in cytoplasm and is very important to renal calcium reabsorption during the development of kidney.

Key words：Calbindin-D28k; mouse; renal development

Calbindin-D28k最初是由Wasserman和Taylor［1］于1966年在鸡小肠粘膜中发现的，其分子量约为27.8×103，由于在小肠中的合成受1，25-二羟基维生素D3水平的调节，故又被称为维生素D依赖性钙结合蛋白（Vitamin D-dependent calcium binding protein，CaBP）［2］。Calbindin-D28k与肾发育关系的研究国外曾见报道［3，4］，但关于小鼠肾发育中Calbindin-D28k表达的定量研究国内尚未见报道。本实验通过蛋白印迹（Western blotting）技术定量检测小鼠肾发育过程中Calbindin-D28k的表达规律，探讨其与小鼠肾发育之间的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物

25～30 g 成年健康昆明小白鼠，由辽宁医学院实验动物中心提供［医动字第 SCXY(辽)2003-2007号］。

1.2 实验试剂

Calbindin-D28k单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供;PVDF膜、SDS、NBT/BCIP、Tween-20、NP-40、PMSF等由SIGMA公司提供。

1.3 标本制备

选用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例1∶1同窝饲养，以阴道栓脱落的最早时间计为胚龄（E）0 d［5］。孕鼠分笼饲养，每日早8∶00、晚5∶00观察生产情况，以仔鼠出生的最早时间计为生后（N）0 d。分别取E10、12、14、16、18 d胎鼠和N1、3、7、14、21、40 d仔鼠，每组8只，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠。

1.4 Western blotting定量检测Calbindin-D28k

各组小鼠取右肾，入液氮迅速冷冻，-85 ℃冰箱保存待用。取冷冻待用的右肾组织，置于1～2 mL匀浆器中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加入4倍体积的裂解液(50 mM Tris-HCl，，pH 8.0 150 mM NaCl，100 μg/mL PMSF，1% TritonX-100) 0 ℃下匀浆、冰上裂解30 min，冷冻离心机(12 000 r/min) 4 ℃，20 min离心去除细胞碎片，取上清液，用考马斯亮兰法测定总蛋白含量。每个样品取25 μg与5×十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液混合，煮沸5 min，100 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗-Calbindin-D28k单克隆抗体(稀释度为1∶400)，二抗-生物素化山羊抗小鼠IgG（稀释度为1∶700 )， NBT/BCIP试剂显色，扫描电泳条带 ，用Gene Tools软件分析电泳条带净吸光度值。

1.5 统计学分析

应用SPSS 12.0统计软件包对实验数据进行统计学分析，数据以±s表示，采用单因素方差分析检验，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

各胚（日）龄小鼠肾Calbindin-D28k表达量电泳结果见图1，净吸光度值见表1、图2。胚龄12 d，Calbindin-D28k表达量极低，无法检测。胚龄14 d到胚龄16 d，Calbindin-D28k表达量增加，差异有显著性意义［（12.0994±0.6911），（13.2383±0.1729），P<0.01］。 胚龄16 d到胚龄18 d，Calbindin-D28k表达量无明显变化(P＞0.05)。胚龄18 d到生后7 d，Calbindin-D28k表达量明显增加，差异有显著性意义［（13.8447±0.2385），（15.2718±0.2019），（16.3208±0.2839），（19.3383±0.4044），P<0.01］。生后7 d到生后14 d，Calbindin-D28k表达量减少，差异有显著性意义［（19.3383±0.4044），（15.8915±1.0185），P<0.01］。生后14 d到生后40 d，Calbindin-D28k表达量无显著变化(P＞0.05)。表1 各胚（日）龄小鼠肾Calbindin-D28k表达量（略）注：aP＜0.01，与前一胚（日）龄比较有显示性差异

3 讨 论

Calbindin-D28k是一种细胞内与钙高亲和力蛋白，存在于与钙转运密切相关的组织中。从系统发育的角度看，Calbindin-D28k是一个古老的大分子，在进化早期，它仅是一个神经蛋白，随着向更高的种族发育，它才被存留于其他组织中，如肾脏、肠道和胎盘［6］。在肾脏，Calbindin-D28k定位于远端肾单位的远曲小管、连接小管、皮质集合管［7］。

在前期研究中，我们应用免疫组织化学技术结合图象分析方法发现Calbindin-D28k在胚龄12 d小鼠胎鼠输尿管芽上皮细胞胞浆内可见微弱的表达。胚龄16 d Calbindin-D28k在输尿管芽壶腹可被明显的观察到，并且随着肾单位发育即S小体的出现，在S小体与输尿管芽壶腹之间的连接小管也出现微弱表达。随着肾发育，Calbindin-D28k的表达逐渐增强，最终定位于小鼠肾远曲小管、连接小管和皮质集合管。本实验进一步采用蛋白印迹技术对Calbindin-D28k表达进行定量分析，发现 Calbindin-D28k从胚龄12 d的胎鼠开始表达到生后7 d的小鼠其表达量逐渐增加，而从生后7 d到生后40 d的小鼠，阳性表达稍减少并趋于平稳，没有显著性的变化。推测从胚龄12 d到生后7 d期间Calbindin-D28k表达的逐渐增强与小鼠肾钙离子转运能力的完善有一定的关系。关于Calbindin-D28k的生理功能，学者们提出了几种理论：载体学说认为Calbindin-D28k作为一种运输蛋白，可与钙离子结合并参与细胞内钙的转运过程。缓冲理论认为Calbindin-D28k可能是细胞内钙缓冲剂，通过与钙离子结合来保持细胞内钙的平衡，防止达到中毒剂量，以保持组织细胞的正常发育。活化剂理论认为Calbindin-D28k增加了管壁膜钙通道的活性，或Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力 ，因而增加了钙的重吸收［8］。总之，对Calbindin-D28k在肾表达的相关研究，将有助于增进对肾发生发育的认识，有利于阐明Calbindin-D28k在肾钙转运中的作用，从而为临床肾钙平衡失调的研究提供基本的实验数据。