介孔分子筛SBA15的脂肪酶固定量分析测定

作者：尚雁 李娜 覃小焕 鲁保旺 傅强

【摘要】 利用吸附法将假丝酵母脂肪酶(candida rugosa lipase，CRL)固定在介孔分子筛SBA15上，对比了由单波长紫外分光光度法、双波长紫外分光光度法和二辛可宁酸法(bicinchoninic acid method， BCA)法测定的酶蛋白浓度及酶蛋白固定量。结果表明: SBA15对紫外吸收有明显干扰，单波长紫外法测定结果远大于双波长紫外法和BCA法，双波长紫外法和BCA法测定结果较接近。利用BCA法测定了不同浓度CRL在介孔分子筛上的固定量，考察了固定化酶的泄漏量。在编号分别为Lu001和LLSD1的介孔分子筛SBA15上的载酶量分别为16.6和114.12 mg/g。在缓冲溶液中SBA15固定化酶的泄漏率只约为0.5%，可作为良好的酶固定化载体。

【关键词】 介孔分子筛SBA15，脂肪酶，酶蛋白固定量，紫外分光光度法，二辛可宁酸法

1 引 言

介孔材料孔径介于微孔与大孔之间，具有大的表面积和多维孔道结构，介孔硅基分子筛SBA15具有高度有序的六边形直孔结构，孔径在5～50 nm范围，对酶分子具有较强吸附能力，是固定化酶的新材料[1]。将酶固定于介孔分子筛上有利于保持酶活稳定性，便于酶的重复利用。高的酶固定量和低的酶泄露量是固定化效果的重要指标。介孔分子筛载体的酶固定量测定方法有紫外分光光度法[2，3]、BCA(bicinchoninic acid method)法[4]、Bradford法[5，6]、凯氏定氮法[7]及Lowry法[8]等。针对不同分析方法的酶固定量测定结果差异以及介孔分子筛干扰未见报道，无法判断不同分析方法所测结果的可比性。为此，本研究分别采用常见的单波长紫外分光光度法、双波长紫外分光光度法和BCA法考察了CRL在介孔分子筛SBA15上的固定量和介孔分子筛对紫外吸收的影响，分析了不同SBA15的固定量差异，考察了固定化酶的泄露量，为将介孔分子筛固定化脂肪酶用于催化反应的后续研究奠定了基础。

2 实验部分

2.1 材料与仪器

TG16高速离心机(19310 g，长沙英泰仪器有限公司);UV2000紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器厂); vertex 70型红外光谱仪(德国Bruker公司);AM3250B型磁力搅拌恒温器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

介孔分子筛SBA15的合成利用表面活性剂Pouronic P123(EO20PO70EO20， 美国Aldrich公司)为模板剂，以浓HCl( 35%～37%)为催化剂，通过对正硅酸乙酯(Si(OC2H5)4， TEOS， 95.0%，日本Junsei Chemical公司)的分解和硅缩聚反应后而得到。编号Lu001和LLSD1的介孔分子筛合成方法基本相同，原料量略有不同，二者的BET比表面积762 m2/g，孔容0.87 cm3/g，孔径7.18 nm，壁厚3.55 nm。柱状假丝酵母脂肪酶(candida rogusa lipase， CRL)购自日本Amano酶技术公司;BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。实验用水为二次蒸馏水。

2.2 傅立叶变换红外(FTIR)测试

样品和KBr在115 ℃下抽真空烘干10 h。将300 mg KBr和2.2 mg样品在研钵中混合研磨成细粉后压片，干燥后立刻置于红外光谱仪的石英原位池中测试。仪器分辨率为2 cm-1，扫描波数范围4000～400 cm-1，扫描128次。

2.3 CRL在SBA15上的固定化

将CRL磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)以3000 r/min离心15 min，收集上清液，得原酶溶液。将适量SBA15放入原酶溶液中，在15 ℃水浴和150～200 r/min下搅拌吸附21 h，再以10000 r/min下离心15 min，收集上清液为吸余液。用磷酸盐缓冲溶液清洗分子筛4次以洗脱疏松附着的酶，洗脱液再以10000 r/min离心15 min，取出上清液为清洗液。测定原酶溶液、吸余液和清洗液的酶蛋白含量，根据物料衡计算得出酶蛋白固定量(immobilized amount of enzyme protein， mg)，取单位质量分子筛的酶蛋白固定量为载酶量(enzyme loading， mg/g)。

2.4 固定化CRL的泄漏

将上述载酶SBA15移入70 mL磷酸盐缓冲溶液中，在15 ℃水浴、以150～200 r/min搅拌并定时取样，样品再以10000 r/min离心15 min，分析上清液中的酶蛋白泄漏量。

2.5 蛋白质定量方法

分别用单波长紫外分光光度法、双波长紫外分光光度法和BCA法测定样品蛋白质含量。单波长紫外法公式为：C(protein)(g/L) =F×A280×D/d，式中A280为280 nm波长处吸光度，D为溶液稀释倍数，d为石英比色皿厚度(cm)，F为校正因子。双波长紫外法WarburgChristian公式为：C(protein)(g/L)=1.55A280-0.76A260; LowryKalckar公式为：C(protein)(g/L)=1.45A280-0.74A260，式中A260和A280分别为260 和280 nm紫外波长下的吸光度。BCA法参照美国Pierce公司蛋白定量方法测定。 分 析 化 学第37卷第8期尚 雁等：介孔分子筛SBA15的脂肪酶固定量分析测定

3 结果与讨论

3.1 蛋白质定量方法对比

图1表明不同浓度CRL溶液在260～280 nm均有一个较强的吸收峰，该吸收峰为蛋白质芳香族氨基酸的特征峰，用于蛋白质含量测定。将粗酶浓度为6 g/L的CRL溶液进行不同倍数稀释，得到一系列相对浓度已知的酶溶液，分别用单波长和双波长紫外法以及BCA法测定酶浓度，验证所测浓度比例关系是否符合其相对浓度，由此得出各检测方法的准确度。图2结果说明BCA法测定结果与样品稀释后的相对浓度最接近，双波长紫外法测定值与BCA法接近，单波长法测定结果远高于BCA法和双波长紫外法。由表1中的相对浓度计算结果可知，BCA法的相对误差最小，单波长和双波长紫外法的相对误差较大。这是因为BCA法的原理是以工作试剂CuSO4中的Cu2+螯合蛋白质分子，发生显色反应测试吸光度，因此抗干扰能力较强，准确度较高。紫外分光光度法操作步骤少，简单快捷，不用显色试剂，不消耗样品。但是，直接检测光密度值受溶液中杂质干扰影响较大，误差较大。

为考察介孔分子筛对吸光度的影响，分别在3 mL蒸馏水中加入0.1， 0.6和0.9 mg SBA15(编号Lu001)，以蒸馏水为参比样，测定其吸光度，并计算出可能对蛋白质测定产生的浓度值偏差。表2说明SBA15有明显紫外吸收。为此，本实验的样品溶液以10000 r/min离心，以消除介孔分子筛对吸光度的干扰。表1 不同方法测定蛋白质浓度的结果表2 SBA15对吸光度的影响 表3为不同定量方法测定的 SBA15(编号为Lu001)对CRL的固定量，3次平行实验的初始粗酶浓度均为6 g/L，SBA15载体用量均为0.36 g，双波长紫外法测定结果略高于BCA法; 单波长紫外法测定结果远高于双波长法和BCA法。表3还说明BCA法的精密度高于单波长与双波长紫外法，这是因为BCA法靠显色反应测试吸光度，灵敏度较高，且介孔分子筛不参与显色反应，抗干扰能力较强，重现性好，更适合介孔分子筛载体的酶固定量和酶泄露量的测试;紫外分光光度法受溶液中杂质和残留介孔分表3 SBA15上的CRL固定量及载酶量

◆: 固定量(amount of immobilized protein); ◇: 载酶量(enzyme loading).子筛干扰较大。由于双波长紫外法测定的酶固定量结果与BCA法较接近，若实验条件有限或者为了不消耗样品且干扰因素较少，可使用双波长紫外法来代替BCA法测定酶固定量，每个样品中的介孔分子筛干扰可通过物料衡算而抵消。

3.2 不同初始酶浓度时BSA15载体上的酶固定量

利用BCA法测定不同初始酶浓度条件下LLSD1对CRL的固定量，图3表明当酶浓度较低时，SBA15载体对CRL的固定量和载酶量随酶浓度的增加而线性增加，但是当酶蛋白浓度达到约0.29 g/L(粗酶浓度约1 g/L)时固定量和载酶量达到平稳，最大载酶量为114.2 mg/g。

3.3 两种SBA15载体的酶固定量

在初始酶浓度均为2 g/L、分子筛用量均为0.12 g相同条件下，LLSD1和Lu001对CRL的固定图4 LLSD1(a)和Lu001(b)的SEM电镜照片

Fig.4 SEM images of LLSD1(a) and Lu001(b)量分别为13.70和2.00 mg;载酶量分别为114.2和16.6 mg/g。可见，LLSD1的固定量及载酶量远大于Lu001。图4为LLSD1和Lu001的SEM电镜照片，可见二者外观形状基本相同，均属于SBA15的传统形状[9]，二者大小也无明显区别。图5是LLSD1和Lu001的FTIR谱图，从图中可看出LLSD1表面上的羟基基团数量大于Lu001。由于酶的吸附是酶和介孔材料表面上的羟基通过氢键作用完成的，介孔分子筛表面上的羟基通过氢键作用可以促进对酶的吸附[10]。因此， 图5 Lu001(1)和LLSD1(2)的FTIR谱图

Fig.5 FTIR spectra of Lu001(1) and LLSD1(2)两种介孔分子筛对酶固定量差异很可能与介孔分子筛的羟基含量有关，具有较高羟基含量有利于固定更多的CRL。

3.4 SBA15固定化酶的泄漏量

固定化酶容易“脱落”到水相中成为游离酶，即“泄漏”[11]。图6表明Lu001固定化CRL在缓冲溶液中100 h后的泄漏率为0.56%，LLSD1的泄漏率为0.53%，泄露量均较低，说明SBA15是良好的酶固定化载体。泄露率较低可能与SBA15孔径大小有关。研究[3，12]表明， 当介孔材料的孔径与酶分子大小相适应时，固定化酶的稳定性较好。Lu001和LLSD1的孔径均为7.18 nm，假丝酵母脂肪酶的动力学直径约为5 nm，二者大小较匹配，使酶分子恰好固定于孔内而不易发生泄露。

◆，■，▲，● 为泄露量(leakage); ◇，口，△，○为泄露率(leakage rate)，其中◆， ◇ ： 0.12 g LLSD1， 载酶量(enzyme loading) 114.2 mg/g; ■，口： 0.24 g LLSD1， 载酶量(enzyme loading) 111.3 mg/g;▲， △： 0.36 g Lu001， 载酶量(enzyme loading) 14.2 mg/g;●，○： 0.36 g Lu001， 载酶量(enzyme loading) 16.6 mg/g。