胚胎小鼠大脑cjun N末端激酶表达的定量分析　

作者：包翠芬 刘霞 魏嘉 梁佳 秦书俭

【摘要】 目的： 探讨cjun N末端激酶(JNK)在胚胎小鼠脑发育中的作用。方法：按受孕时间将昆明小鼠随机分为6组，分别为胚龄10（E10）、12（E12）、14（E14）、16（E16）、18d（E18）组、新生组（P0），采用免疫印迹技术和光密度分析法对各组小鼠脑JNK进行定量检测，以测得的JNK最大量为1(100%)，计算蛋白相对含量。 结果：免疫印迹法测得E10、E12、E14、E16、E18及P0组JNK1含量分别为24.57%、46.62%、62.99%、82.06%、100%、89.65%，JNK2/3含量分别为58.89%、51.37%、28.67%、20.33%、6.54%、5.03%。结论： JNK在胚胎发育期间呈明显的变化规律，提示JNK可能在小鼠大脑的发生与发育中起重要作用。

【关键词】 小鼠； 脑； JNK； 免疫印迹

免疫印迹技术原理是将凝胶电泳的分辨力和免疫化学检测的特异性融为一体，首先借助凝胶电泳将蛋白质抗原分离，然后将凝胶中的蛋白质转印至膜上，使之成为被分离蛋白的一个拷贝，抗原的位置即可用特异性抗体确定。目前免疫印迹技术是科研中常用的蛋白定量检测方法，该方法具有高效、灵敏等特点。本实验应用免疫印迹法对胚胎小鼠大脑组织cjun N末端激酶(cJun Nterminal Kinase，JNK)的蛋白含量进行检测，以探讨JNK在胚胎小鼠脑发育过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

取成年昆明小鼠（辽宁医学院实验动物中心提供），按小鼠孕期随机分为E10、E12、E14、E16、E18及P0组［1］。每组10只。

1.2 主要试剂及仪器

兔抗小鼠JNK单克隆抗体（NeoMarker公司），细胞裂解液、PowerPac 3000电泳仪、Transblot SD半干转膜仪(美国BioRad公司)。

1.3 免疫印迹检测步骤

分别取胚龄10、12、14、16、18天及新生鼠大脑称重，PBS冲洗，迅速置于液氮冷冻，-70℃冰箱保存。取冷冻脑组织，加入3倍体积的细胞裂解液，0℃下剪碎、匀浆，将组织匀浆液静置30min，4℃、12000rpm 离心10min，留取上清液。用Bradford法测定蛋白含量，分装成每离心管中含10μg蛋白，-20℃冰箱保存。

配制10%分离胶和5%浓缩胶，取含10μg脑组织蛋白细胞裂解上清液，加入10μlSDS样品缓冲液，100℃加热3min，离心。取上述裂解液加入电泳胶样品槽，100V电压下电泳，待样品到达合适位置，停止电泳，将胶板取下，转膜液洗涤10～30min。将胶与0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇内浸透5min左右，再放入转膜液中至少5min)置于厚滤纸(已用转膜液浸泡)之间，赶尽气泡，常温下半干转印，转印完成后将PVDF膜用TBST(TBS-1% Tueen20溶液)冲洗，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1～2h。与一抗(兔抗小鼠JNK抗体，稀释度为1∶400)4℃孵育过夜，TBST洗脱3次，每次至少5min； 再与二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体，稀释度为1∶200)室温孵育1h，TBST溶液洗脱3次， 每次至少5min；NBT/BCIP显色；扫描电泳条带，输入电脑，用光密度分析软件分析电泳条带光密度。

1.4 统计学分析

应用SPSS10.0软件分析，所有数据均用 ±s表示。多组间差异显著性检验采用单因素方差分析。

2 结果

Wester blot电泳条带图光密度分析：由光密度分析得之，E18组JNK1含量最高，以该组百分数计做100％，计算各组JNK表达相对含量（图1、表1）。JNK1于E10组含量最低，随胚龄的增长其含量逐渐升高，至E18组升至高峰，至P0组含量略微降低；JNK2/3于E10组含量最高，随胚龄的增长JNK含量逐渐降低，至P0组降至最低水平。表1 昆明小鼠生后肾JNK Wester blot电泳条带光密度百分数(％)注：* 与前一胚龄组比较，P<0.01。

3 讨论

JNK家族是丝裂素活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases， MAPK) 超家族成员之一，属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是中枢神经系统内主要的信号转导通路之一。JNK最早提出于1991年，研究者发现，用紫外线照射细胞后，一种蛋白激酶能够使cJun氨基末端活性区Ser63和Ser73发生磷酸化，据此把该蛋白激酶称为cJun氨基末端激酶(cJunNterminal kinase，JNK)［2］。现已证实有三组编码JNK的基因，在人类分别为JNK1，JNK2，JNK3，在鼠类也存在相应的基因，其中JNK1和JNK2/3的分子量分别为46kD和54kD，且表达广泛。JNK家族可被细胞因子、生长因子、应激(如电离辐射、渗透压、热休克和氧化损伤)等多种因素激活，大量实验提示JNK信号通路在细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用，因此JNK信号通路是正常与疾病状态时细胞的一个重要调节靶点。

本实验结果显示，JNK2/3的表达随着胚龄的增长而呈现下降趋势，至出生时达最低水平；而JNK1的表达则相反，随着胚龄的增长呈现上升趋势，至E18组达到高峰，但出生时又略有下降，可能与出生时应激反应有关，以上结果提示JNK与小鼠大脑的发生与发育过程是密切相关的。Oliver等研究发现JNK的磷酸化促进了胚胎时期体轴的形成［3］。Kuan等研究表明，缺失JNKl或JNK2或JNK3或JNK1/JNK3或JNK2/JNK3的小鼠均正常存活，而缺失JNK1/JNK2导致胚胎死亡，表现出严重的脑内凋亡调节障碍，即在早期胚胎发育过程中，后脑凋亡减少并呈现畸形，但前脑的形态发生有明显增强的凋亡反应，提示JNKl和JNK2调节脑发育早期区域特异的凋亡［4］。Liu MG等根据小鼠伤害性疼痛过程中JNK的三种亚型在中枢神经系统表达的部位不同，推断出三种亚型在功能上既有差异，又相互联系［5］。因此，研究不同胚龄时期小鼠大脑（海马和皮层神经元）发育过程中JNK家族的基因表达趋势及其调控机制，是探索哺乳动物中枢神经系统发生、发育分子生物学机理的有效途径之一。

【参考文献】 1 王灵均，郭敏，陈河.小鼠脑小体的形态发生.解剖学报，2005，36(1):99～102. 2 Yelena Lyustikman， Hiroyuki Momota， William Pao， et al. Constitutive Activation of Raf1 Induces Glioma Formation in Mice. Neoplasia， 2008，10(5): 501～510. 3 Oliva AA Jr， Atkins CM， Copenagle L，et al. Activated cJun Nterminal kinase is required for axon formation. J Neurosci， 2006，26(37):9462～9670. 4 Toyoda H， Zhao MG， Xu H， et al.Requirement of extracellular signalregulated kinase/mitogen activated protein kinase for longterm potentiation in adult mouse anterior cingulate cortex. Mol Pain， 2007，3 (1):36. 5 Liu MG， Zhang FK， Guo SW， et al.Phosphorylation of cJun Nterminal kinase isoforms and their different roles in spinal cord dorsal horn and primary somatosensory cortex.Neurosci Lett， 2007，427(1):39～43.