胚胎小鼠肾脏发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析

作者：穆长征 王小梅 陶仕英 刘霞 包翠芬

【摘要】 目的：探讨神经型一氧化氮合酶在胚胎小鼠妊娠不同时期肾脏发育中的意义。方法：选用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例3：1同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。选取胚龄12天(ED12)、14天(ED14)、16天(ED16)、18天(ED18)的胎鼠及出生时(PD0)仔鼠，分5组，每组各6只母鼠，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠，剖腹取肾脏，用免疫印迹技术（Western blot ）及光密度分析系统分别对各组胎鼠或仔鼠肾脏内nNOS进行定量检测。结果 ： Western blot及光密度分析显示， ED14组肾脏nNOS含量最少，随后逐渐增多，PD0组肾脏nNOS含量最多。结论：胚胎小鼠肾脏nNOS在胚胎第14天开始呈阳性表达，以后含量逐渐升高，出生时含量最高，表明nNOS在胚胎小鼠肾脏发育的早期阶段起重要作用。

【关键词】 神经型一氧化氮合酶； 胚胎小鼠； 肾脏

一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase， NOS）是一氧化氮（NO）合成的限速酶，是调节NO的重要环节。NO通过NOS产生，是一种可作为信使分子的自由基气体［1］，可激活可溶性鸟苷酸环化酶，通过生成cGMP而发挥作用。NOS可分为内皮型（endothelial NOS，eNOS）、神经型（neuronal NOS， nNOS）和诱导型（inducible NOS，iNOS）3类。NO在肾脏血流动力学和肾脏多种生理功能中的作用决定NOS的活性改变，NO可通过调节肾小球毛细血管压和管球反馈来调节肾血流量，是有效调节肾脏的血液动力学的舒张因子，能对抗缩血管物质，参与调节血管张力。尽管国内外学者对成年肾脏NOS的表达进行大量的研究，但nNOS在胚胎肾发育过程中动态表达尚未见报道。本实验通过观察妊娠不同时期胚胎小鼠肾脏nNOS的表达，旨在探讨nNOS在胚胎小鼠肾脏早期发育中的意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物

昆明小白鼠，由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂

丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、甘氨酸购于北京中杉金桥生物技术有限公司；Tween-20、Tris、SDS和硝酸纤维素膜购于华美公司。

1.3 动物培养与分组

选用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例3：1同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。以观察到阴道栓脱落的最早时间计为0天。记录受孕时间，然后将孕鼠分笼饲养，每日早8时、晚5时观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为出生时。选取胚龄12天(ED12)、14天(ED14)、16天(ED16)、18天(ED18)的胎鼠及出生时(PD0) 仔鼠，分5组，每组各6只母鼠，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠。

1.4 Western blot测定肾脏nNOS含量

各组胎鼠或仔鼠脊椎离断后剖腹取左肾，PBS冲洗，滤纸吸干，将完整左肾入液氮迅速冷冻，-70℃冰箱保存待用。取冷冻待用的左肾组织，加入3倍体积的细胞裂解液，0℃下剪碎、匀浆，将组织匀浆液静止30min，冷冻离心机（10000r/min）离心10min，取15μl上清液，用Bradford 法测定蛋白含量后，分装成每离心管中含10μg蛋白，-20℃保存备用。

配置8%SDS聚丙烯酰胺分离胶和5%的浓缩胶，取10μg肾组织蛋白细胞裂解上清液，加入10μl SDS 样品缓冲液，100℃加热3 min，离心。然后取上述裂解液，加到电泳胶的样品孔，100V电压下电泳，待指示剂达到分离胶时，将电压增至200V，直到指示剂达到胶的底部。将胶板取下，在转移缓冲液中洗涤10min，将胶与0.45μm硝酸纤维素膜置于滤纸与海绵之间，赶尽气泡，常温下，半干转印。至转印好的硝酸纤维素膜，TBS（Tris 盐缓冲液）冲洗2遍，5%脱脂奶粉溶液室温封闭4℃过夜，分别与一抗（兔抗鼠 nNOS多克隆抗体）（稀释度为1：400），4℃孵育过夜，TBST（TBS-0.5%Tween-20溶液)洗脱3次，再与二抗-HRP标迹的羊抗兔IgG抗体（稀释度为1：200）室温孵育1h，以TBST溶液洗脱3次后与DAB试剂显色，扫描电泳条带，用Band Leader软件分析电泳条带光密度。

1.5 统计学分析

应用SPSS11.5统计软件包进行统计分析，所有数据均以均数±标准差（x±s）形式表示，采用双因素方差分析和q检验。以P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

以测得的nNOS最大值为1，计算各组nNOS表达相对含量(百分数)。PD0组含量最高（100%）， ED14组nNOS含量最低（46.6±2.8%，两者比较P＜0.01)，ED16组含量升高（为57.3±3.6 %，与ED14组比较P＜0.05），ED18组含量进一步升高（为77.5±3.2 %，与ED16组比较P＜0.01， 与PD0组比较P＜0.01）。胚胎小鼠不同发育阶段nNOS含量分析用Western blot电泳条带和光密度百分数表示。 见表1、图1、图2。表1 小鼠不同发育阶段肾脏nNOS表达的光密度（%）（略）注：*与ED14组比较P＜0.05；▲与ED14组比较P＜0.01，#与ED16组比较P＜0.01；△与ED18组比较P＜0.01。

3 讨论

NO对肾血流量和局部微循环具有重要的调节作用［2］。Solhaug［3］证实，NO是唯一在新生动物中具有血管舒张功能的因子。他认为与成年肾脏相比，由于新生肾脏含有大量高活性血管收缩因子，其中包括肾素、血管紧张素系统，这些因素导致新生肾脏血管阻力（RVR）高，RBF和GFR低，且处于低氧环境使肾脏血管阻力（RVR）进一步增高［4，5］，为了维持胚胎小鼠肾脏早期发育阶段的肾血流量，保护肾免受损伤，NO作为有效的调节肾脏血液动力学的舒张因子，能对抗缩血管物质，参与调节血管张力，维持基本肾血流量和增加肾小球滤过率［6］。在肾脏早期发育过程中，NO主要通过舒血管效应调节肾RBF与GFR，在调节胚胎肾脏功能方面起着重要作用。

本实验的免疫印迹结果发现，胚胎小鼠不同发育阶段中，出生时的肾脏nNOS含量最高。nNOS是一种结构酶，其表达越多，产生NO越多，作为胚胎小鼠体内唯一的血管舒张功能因子，通过对抗高活性血管收缩因子特别是血管紧张素Ⅱ的作用，增加肾RBF及GFR，调节肾脏正常的生理活动。一般认为胚胎动物的RBF最小，肾脏nNOS含量最高，以后逐渐降低，这是由于随着肾功能的自我完善、RBF的增加造成的。因此胚胎小鼠的高RVR、低RBF、低GFR的生理特点是促使nNOS表达的主要因素。此外nNOS的表达还与细胞自身的生长发育与增殖、母体的环境以及肾脏自身血液动力学相关。出生时动物具有高的雌激素和雌激素的受体，不同实验发现雌激素能通过增加基因的转录水平上调nNOS mRNA表达，因而在胚胎小鼠nNOS的表达可能受母体的雌激素影响［7，8］。另外生长因子也能上调nNOS的表达，转录生长因子-β1（TGF-β1）在肾发育中高度表达，在细胞的培养中，它可以直接刺激nNOS的表达［9］。更有一些学者认为［10］，低氧参与nNOS的合成与调节，胚胎动物一般处于缺氧状态，它能上调nNOS的表达。

综上所述，我们认为胚胎小鼠RBF变化与nNOS有密切关系。由此推断在肾脏功能发育的早期，nNOS对肾脏血液动力学的调节起着重要作用。