余甘子叶中的没食子酸的定性定量分析研究

作者：钟振国，李学坚，董明姣，刘布鸣，陈明生，韦勇汉，陆盛胜，钟益宁，黄金兰，韦小清

【摘要】 目的对余甘子叶中的没食子酸进行分析研究，建立定性定量分析方法，为余甘子叶的质量标准制定提供方法和依据。方法采用薄层色谱进行定性鉴别；定量方法采用液相色谱测定余甘子叶中没食子酸的含量：以C18柱，流动相：甲醇-0.2%磷酸(3∶97)；流速1.0 ml/min ；检测波长为269 nm；外标法定量。结果没食子酸在0.23～1.38 μg范围内呈线性关系，平均回收率为102.1%（RSD=1.38%）；分别对不同产地的样品进行了测定。结论该方法简便、准确，专属性强，重复性、回收率好，可作为余甘子叶药材的质量控制方法。

【关键词】 余甘子叶 没食子酸 薄层色谱 液相色谱

余甘子叶为大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus embllca L.的叶，余甘子树广泛分布于我国的广西、广东、福建、贵州、云南等地。余甘子为传统民族用药，具有清热凉血、消食健胃、生津止咳之功效，用于血热血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛、口干［1］。余甘子中含没食子酸并作为检测指标［1］，但目前对余甘子叶的化学研究不多，其分析方法研究未见报道。本课题组采用薄层色谱法和液相色谱法，以主要成分之一的没食子酸为对照，对余甘子叶进行了定性定量分析方法研究，并对不同产地的样品进行了分析比较，为该植物的进一步开发利用提供基础化学数据，为余甘子叶药材及其制剂的质量标准研究奠定基础和依据。

1 器材

1.1 仪器与试药

美国Waters 515 HPLC Pump、2487 DualλAbsor bance Detector液相色谱仪，威玛龙色谱工作站；KQ5200B型超声清洗器；硅胶G，青岛海洋化工厂出品没食子酸对照品（110831-200302），由中国药品生物制品检定所提供；水为超纯水，甲醇为色谱纯；其它试剂均为分析纯。

1.2 样品

余甘子叶采自广西各地，经广西中医学院刘寿养教授鉴定为大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus embllca L.的叶。晾干。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

取余甘子叶粉碎，称取2 g，加水煮1.5 h，滤过，滤液用盐酸调pH值至2，用乙醚连续萃取两次，取乙醚层，挥干，残渣加醋酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取余甘子叶对照药材同法制成对照药材溶液。再取没食子酸对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述各种溶液各1～2 μl，分别点于同一含羧甲基纤维素纳为粘合剂的硅胶G薄层板上，以甲醇（水饱和）－甲酸乙酯－甲酸（5∶4∶1）为展开剂，展开，取出晾干，喷以5%FeCl3溶液。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，Rf=0.45，见图1。经多批样品试验，薄层色谱的重复性好，可作为余甘子叶的定性鉴别方法。

2.2 含量测定

2.2.1 液相色谱测试条件色谱柱：迪马C18柱，流动相：甲醇-0.2%磷酸(3∶97)，流速1.0 ml/min，检测波长269 nm，柱温室温，进样量10 μl。

2.2.2 色谱条件与系统适用性实验检测波长：取没食子酸对照品适量，以流动相为溶剂，用紫外分光光度计在200～350 nm波长范围内扫描，测得没食子酸最大吸收波长为269 nm，故检测波长选择269 nm。与文献报道没食子酸的检测波长相同［2］。

系统适用性：在本色谱条件下，理论板数按没食子酸峰计算不低于3 000，没食子酸峰与相邻组分色谱峰达到完全分离，分离度大于1.5，没食子酸保留时间约为18 min。样品与对照品色谱见图2～3。

2.2.3 提取条件的选择取同一批余甘子叶，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%的甲醇水溶液30 ml，密塞，称定重量，分别按不同的时间超声处理，放冷，用50%甲醇水补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定没食子酸含量，结果表明在超声处理60，90 min与120 min的条件下余甘子叶中没食子酸成分提取效果相差不大，为便于操作，缩短分析时间，选择超声时间为60 min。结果见表1。表1 余甘子叶在不同超声处理时间测定结果（略）

2.2.4 溶液制备对照品溶液的制备：精密称取11.5 mg没食子酸对照品，置于10 ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取0.5 ml，置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为没食子酸对照品溶液。

供试品溶液的制备：取余甘子叶2.0 g，剪碎后精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密量取的50%甲醇30 ml，称定重量，超声1 h，放冷补重，滤过，取续滤液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，作为供试品溶液。

2.2.5 线性关系考察精密称取没食子酸对照品11.5 mg，置10 ml容量瓶中，用动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml置于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得系列标准溶液，按上述色谱条件分别注入色谱仪，进样10 μl，测定没食子酸峰面积值，以没食子酸峰面积值Y为纵坐标，没食子酸进样量X(μg)为横坐标，求得没食子酸标准曲线回归方程为：峰面积Y=7 194 951.677 0X-63 661.600 0（n=6），r=0.999 9，表明没食子酸进样量在0.23～1.38 μg范围呈良好线性关系。

2.2.6 精密度实验取供试品溶液，连续重复进样6次，测定样品中没食子酸峰面积积分值并计算相对标准偏差，测得平均值为：3 654 170，RSD= 1.42%。

2.2.7 稳定性实验取供试品溶液，在上述色谱条件下，10 h内间隔一定时间进样，测定样品中没食子酸峰面积积分值并计算相对标准偏差，测得平均值为：3 713 586，RSD=1.26%。

2.2.8 重复性实验精密称取同一批余甘子叶样品各6份，按“2.2.4”项下进行操作，测定没食子酸的含量(mg/g)并计算相对标准偏差，结果测得没食子酸平均含量为0.780 mg/g，RSD=1.66%(n=6)。

2.2.9 加样回收率实验分别精密称取已测知没食子酸含量（0.780 mg/g）的余甘子叶样品，剪碎，共9份，每份1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按低(0.575 0 mg)、中(0.805 0 mg)、高(1.035 0 mg)3个不同的加入量，精密加入没食子酸对照品溶液（0.575 mg／ml）。混匀后按供试品溶液制备和没食子酸含量测定方法提取、测定，计算平均回收率，结果平均回收率为102.1％，RSD=1.38％。

2.2.10 样品测定 取不同产地余甘子叶样品，按上述方法进行含量测定。结果见表2。表2 余甘子叶中没食子酸含量测定结果（略）

3 讨论

本实验建立了余甘子叶中没食子酸的定性定量分析方法，方法简便、快速，专属性强，重复性好，可作为余甘子叶的质量控制方法。

本实验测定了不同产地的余甘子叶，结果均能检出没食子酸，但含量有所差异，相差近10倍。

流动相的配比对没食子酸的色谱峰有较大影响，甲醇-0.2%磷酸为5∶95时，没食子酸出峰时间较快，样品中没食子酸峰未能与其他杂质峰有较好地分离；甲醇-0.2%磷酸为3∶97时，没食子酸出峰时间相对较慢，但与相邻峰的分离效果最好，色谱峰形对称，因此选择3∶97的流动相配比。