应用组织芯片技术评估大肠癌手术切缘分子边界的初步研究

作者：李楠，王景美，吴平平，徐佳佳，丁洁，方媛，黄培林

【摘要】 目的： 通过分析p53、Ki67在癌组织和癌周不同距离（距离肿瘤1、2、3 cm）组织中的差异表达，探讨大肠癌手术切缘的分子边界。方法： 应用组织芯片技术和免疫组织化学方法研究44例大肠癌组织和癌周不同距离组织中p53、Ki67的表达情况。结果： p53、Ki67在大肠癌组织和癌周不同距离（距离肿瘤1、2、3 cm）组织中的表达呈现逐渐减弱的趋势，其递减表达差异具有统计学意义。结论： p53、Ki67所表现出的趋势性差异表达提示，在大肠癌手术切缘组织中存在分子边界。应用组织芯片大规模检测临床组织样本，具有快速、方便、经济、准确的特点。

【关键词】 大肠癌；组织芯片；分子边界；p53；Ki67；手术切缘

大肠癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，由于其起病隐匿，早期常无明显的临床表现，故极易延误诊断和治疗，严重地威胁着人类健康。目前，手术切除是治疗大肠癌的最主要手段之一，而术后局部复发是手术治疗失败和影响患者预后的重要原因，因此手术成功与否成为影响大肠癌预后的主要因素。传统方法判断手术切除是否干净主要基于对切缘组织的常规病理学（即细胞形态学）观察，然而最近研究表明，肿瘤在细胞形态发生明显变化之前［1］，其分子水平及生化代谢水平方面已发生异常改变，出现功能异常的癌基因产物或产物表达增强，即在肿瘤及其切缘组织中存在着分子边界［2］。本研究利用组织芯片技术和免疫组织化学方法对大肠癌组织和癌周不同距离（距离肿瘤1、2、3 cm）组织p53、Ki67的表达进行分析，初步探讨大肠癌手术切缘的分子边界。

1 材料与方法

1.1 实验材料

收集南京大学医学院附属鼓楼医院病理科2007年9月至2008年1月间各类大肠癌组织和癌周不同距离组织（距离肿瘤1、2、3 cm）标本。所有病例临床资料完整，标本均经10％中性福尔马林固定，常规处理后石蜡包埋。

1.2 主要试剂和仪器

p53兔抗人单克隆抗体工作液和Ki67鼠抗人单克隆抗体工作液购自北京中杉公司，组织微阵列打孔系统购自美国Beecher Instrument公司，组织芯片载体购自德国MenzelGlaser SuperFrostoPlus公司。

1.3 实验方法

所有病例复诊并在HE切片的典型部位作标记，将HE切片与供体蜡块对照，在供体蜡块相应位置作出标记并取样，移植至受体蜡块上，制成大肠癌组织和癌周不同距离（距离肿瘤1、2、3 cm）组织的组织芯片蜡块；按同样方法构建另一个包含相同病例且阵列相同的组织芯片蜡块以进行实验重复；分别连续4 μm厚切片，制备成组织芯片备用。对组织芯片进行EnVision两步法免疫组化染色，实验步骤按试剂盒说明书进行，每个检测指标均在另一张组织芯片上重复1次。统计分析p53、Ki67的表达情况。

1.4 结果评定

p53、Ki67蛋白均定位于细胞核，无背景着色情况下以细胞出现黄色颗粒者为阳性。综合考虑染色强度和阳性细胞数，采用半定量积分法[3]判定免疫组化染色结果：计算阳性细胞百分数并赋予分值，≤5％为0分，6%～25％为1分，26%～50％为2分，51%～75％为3分，>75％为4分；观察着色强度并赋予分值，无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两者相乘，0分为（-），1～4分为（+），5～8分为（++），9～12分为（+++）。同一病例的评分结果取平均值作为该病例的最终评分。

1.5 统计学处理

各组数据的比较采用KruskalWallis检验和Wilcoxon检验。

2 结果

2.1 p53的表达情况

p53在癌组织和癌周不同距离（距离肿瘤1、2、3 cm）组织表达的总体差异具有统计学意义（P<0.000 1）（表1、图1）；经两两比较，癌组织和距离肿瘤1 cm组织、癌组织和距离肿瘤2 cm组织、癌组织和距离肿瘤3 cm组织（P<0.000 1）、距离肿瘤1 cm组织和距离肿瘤2 cm组织、距离肿瘤1 cm组织和距离肿瘤3cm组织（P<0.05）中p53的表达均有差异，但是距离肿瘤2 cm组织和距离肿瘤3 cm组织中p53的表达无差异（P>0.05）（表2）。表1 KruskalWallis检验p53在癌组织和癌周(距离肿瘤1、2、3 cm)组织中的表达

2.2 Ki67的表达情况

Ki67在癌组织和癌周不同距离组织（距离肿瘤1、2、3 cm）表达的总体差异具有统计学意义（P<0.000 1）（表3，图2）；经两两比较，癌组织和距离肿瘤1 cm组织、癌组织和距离肿瘤2 cm组织、癌组织和距离肿瘤3 cm组织、距离肿瘤1 cm组织和距离肿瘤2 cm组织、距离肿瘤1 cm组织和距离肿瘤3 cm组织（P<0.000 1）、距离肿瘤2 cm组织和距离肿瘤3 cm组织（P<0.05）中Ki67的表达均有差异（表4）。表3 Ki67在癌组织和癌周(距离肿瘤1、2、3 cm)组织中表达的KruskalWallis检验

3 讨论

恶性肿瘤手术治疗的原则是彻底切除原发病灶，获得阴性切缘。确立一个真正安全的手术切缘，对预防患者的局部复发和预后良好均有着重要的意义。常规病理学检测出的癌细胞阳性切缘与切缘中仅有分子生物学变化者不同，后者仅有基因改变而无形态学改变，可能处于肿瘤发生的早期阶段，这有可能成为肿瘤复发的根源。因此，确定肿瘤手术切缘的分子边界可进一步提高手术切缘诊断的敏感性，对预防患者术后复发和评估预后都具有重要的意义。国内邵根泽等［4］通过检测食管癌手术切缘组织p53基因突变，首次提出了切缘分子边界的概念。他们发现切缘组织p53基因突变患者预后差，其肿瘤复发率为46％；p53基因无突变者无一例复发，两组复发率差异具有统计学意义（P<0.05），提示检测切缘组织p53基因突变有助于食管癌手术评估和预后判断。目前，胃癌［5］、肺癌［6］、前列腺癌［7］、膀胱癌［8］、子宫颈癌［9］等多种肿瘤手术切缘的分子边界均被广泛研究，但大肠癌手术切缘的分子边界尚无研究报道。因此，本研究应用组织芯片技术和免疫组织化学方法对大肠癌手术切缘的分子边界进行初步研究。

p53是最常见的抑癌基因之一，位于人17p13.1，编码相对分子质量为53 000的蛋白质。正常情况下，在DNA损伤后p53能将细胞阻滞在G1期，抑制细胞增殖，促进DNA修复。p53突变后则不能调控细胞增殖，使肿瘤细胞生长失控甚至侵袭力增加，导致肿瘤发生和转移，且其突变几乎见于所有的人类肿瘤中。Ki67是存在于增生细胞核的一种非组蛋白核蛋白，是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，位于染色体10q25上，相对分子质量为345 000。其功能与染色质相连及与细胞的有丝分裂密切相关，被认为是较理想的检测细胞增殖活性的指标，被广泛应用于研究各种肿瘤患者的细胞增殖活性以及细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为及预后的关系。我们对44例大肠癌患者癌组织和癌周不同距离（距离肿瘤1、2、3 cm）组织中p53、Ki67的表达情况进行了检测，结果表明，p53和Ki67在大肠癌组织到癌周不同距离组织之间的表达强度呈现逐渐减弱的趋势，该递减表达具有统计学意义。提示在大肠癌周围组织及切缘组织中存在分子边界，在此边界两侧基因的表达存在明显差别，这种基因的差异表达是呈渐进性的，即随着癌的发生基因表达逐渐增高或降低。对大肠癌手术患者切缘进行分子生物学检测，确定其手术切缘的分子边界，不仅能筛选出预后差的患者，更重要的是可以对这些患者进行及时的干预，以提高其生存率。明确大肠癌手术切缘的分子边界对预防大肠癌患者术后复发和评估预后都具有重要的意义。

组织芯片（tissue chips）也称组织微阵列（tissue microarrays，TMAs），是1998年由Kononen等在cDNA微阵列的基础上发明的一种特殊的生物芯片，它是将数十个、数百个乃至上千个小的组织片整齐地排列在某一载体上而形成的微缩组织切片［10］。组织芯片具有体积小、信息含量高并可根据不同的需要进行组合和设计的特点，一次性实验即可获得大量结果。该技术将基因、蛋白水平的研究与组织形态学相结合，达到了高通量、多样本的目的，减少了实验误差，提高了组织病理学研究的效率，使实验结果有更可靠的可比性，并且为原始病理资料的保存和进行大样本量的回顾性研究提供了可能［11］。每个组织芯片蜡块可做100～200张的连续切片，可用同一种组织芯片对上百种分子标记物进行检测、分析，可做特殊染色、免疫组化染色、原位杂交、荧光原位杂交等。本实验应用组织芯片大规模检测临床组织样本，具有快速、方便、经济、准确的特点。

多种基因异常表达与肿瘤的发生、发展间存在着密切的相关性，组织芯片技术可高通量、多样本地对肿瘤手术切缘处基因异常表达进行检测，这不仅能从分子层面研究手术切缘的分子边界，帮助人们进一步认识肿瘤的发生及发展，还有助于革新肿瘤手术的治疗方案，提高临床治疗效果，值得进一步深入探究。