药物靶标的发现与验证技术研究进展

【摘要】 药物靶标的发现和验证是新药研发的第一步，也是药物筛选及药物定向合成成败的关键因素之一。随着基因组学、蛋白组学、生物信息学的快速发展，以及RNA干扰、噬菌体展示等新兴技术的出现，药物靶标的发现和验证技术日新月异。该文综述了在基因水平、转录水平、蛋白水平药物靶标发现和验证的各种技术的研究进展及其成功案例。

【关键词】 药物靶标;靶标发现;靶标验证

Abstract：Drug target discovery and verification is not only the first step of investigation of new drug， but also one of the most important factors in drug screening and directional synthesis. With the fast development of genomics， proteomics， bioinformatics and the advancement of new techniques， such as RNA interference and bacteriophage display， the discovery and verification of drug target is changing with every passing day. In the present paper， the development and successful cases of drug discovery and verification were reviewed.

Key words： Drug target;Target discovery;Target verification

药物靶标是寻找药物的基础，在过去的几个世纪中，人们很大程度上是依赖目前已知的五百多个药物靶标来发现药物。基因组研究表明，人类有3～4万个基因和更多的蛋白质，其中许多蛋白质是控制人类疾病的潜在的药物靶点，因此至少有 9/10 的药物靶点蛋白尚未被发现。发现并验证药物新靶标对阐明疾病原因、药物作用机制具有重要意义，是产生“重磅炸弹”式创新药物的源头。近年来，随着基因组学、蛋白组学、生物信息学的快速发展，以及RNA干扰、噬菌体展示等新兴技术的出现，新的药物靶标搜寻和验证方法不断出现。因此，本文拟从基因水平、转录水平和蛋白水平，就药物靶标发现和验证技术的研究进展作一综述。

1基因水平的药物靶标发现和验证

1.1从基因数据库中搜寻药物靶标20世纪90年代以来，表达序列标签(expressed sequence tag，EST)数据库被广泛应用于新基因搜寻，如成功搜寻到了组织蛋白酶K 和阿立新受体等[1]。相对于EST 数据库，人类基因组数据库的序列信息更为完整，但它不能提供不同组织的表达信息，因此人们开始将EST 数据库与基因序列数据库结合起来搜索新的药物靶标。2001年，3个不同研究小组分别应用不同方法，以H3 受体为参照，利用BLAST，FAST-PAN 和TFAST 程序，搜索到5 种新的H4 基因，这些基因都以标准分子生物学方法确认，可作为疾病治疗候选药物靶标。

1.2基因芯片技术基因芯片技术是在微小的基片表面集成了大量的分子识别探针，应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片技术可以同时筛选、鉴别药物或疾病相关基因，同时将这些基因与之功能联系起来，因此在药物靶标发现和验证过程中是一个强有力的工具。但是由于芯片技术本身尚不十分成熟，在大量数据处理之后还需要大量的验证工作;它反映的是mRNA 表达水平，而这未必与蛋白表达和功能一致，这使它在药物靶标发现和验证领域的应用受到一定限制。虽然如此，仍有许多成功应用的例子[2]。此外，基因芯片技术在阿尔茨海默病[3]、帕金森病[4]、恶性肿瘤[5]等疾病的药物靶标研究中也发挥了很大作用。

1.3基因敲除技术基因敲除(gene knockout)是指对一个结构已知、而功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它序列相近的基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。基因敲除模型在发现基因功能和药物作用新靶点的发现方面具有高度价值，同时也有助于确定药物作用于特定靶点后的不良反应。目前，研究者正在系统地敲除鼠固有基因，并根据哺乳动物生理学特点确定它们在体内的功能，这一研究足已覆盖几乎所有的蛋白质和可用于药物研究的基因家族，如离子通道、核激素受体、蛋白酶、磷酸二酯酶、激酶、磷酸酶及其它关键的酶类。同时，基因敲除技术也已广泛应用于确证药物在免疫[6]、动脉粥样硬化[7，8]、高血压病[9]、糖尿病[10]和肿瘤[11]等疾病中的作用靶点。

2转录水平的药物靶标发现和验证

2.1反义寡核苷酸技术反义寡核苷酸技术是利用反义寡核苷酸或修饰的寡核苷酸与特定靶mRNA 的一部分互补，抑制mRNA 的翻译和剪接，从而抑制其编码的蛋白质的表达。与基因敲除技术相比，尽管这种方法是一种更加省时省力的研究目的基因的强大工具，但还是有局限性，如体内应用时生物利用度有限，毒性较大。利用反义技术验证药物靶标也有一些成功的例子。如Jarvis等[12]利用磷酸化的反义序列作用于P2X3 受体的1100～1119 和1166～1185 位点序列，证明P2X3 受体是慢性炎症和神经痛的重要角色，据此为靶点发现了一种小分子A-317491。Okabe 等[13]利用cDNA 芯片技术分析临床肝癌样品发现，DDEFL1(development and differentiation enhancing factor-like 1)基因在肝癌组织中表达异常，进而以硫代反义核酸抑制此基因的表达，结果肿瘤细胞的生长受到抑制，提示DDEFL1 可以作为肝癌的潜在治疗靶点。

2.2RNA干扰 (RNA interference， RNAi) 技术

2.2.1RNA干扰用于发现新药靶RNA干扰技术自诞生以来，已被广泛应用于药物靶标的发现与确证，这主要是由于该技术具有很多其他技术所无法比拟的优点：能特异高效地抑制基因表达，获得去基因功能表型;仅需要少量的核酸序列信号，而且不被蛋白结构影响;siRNA 的合成和控制较基因敲除或其他方法简单易行、资金消耗少、周期短，使得我们能够在短时间内大规模筛选靶点，而且可以通过质粒或病毒载体表达的小发卡RNA(small hairpin RNA， shRNA)干扰目的基因，从而达到了在细胞水平和动物水平筛选药物靶标的目的[14， 15]。研究表明，RNAi 技术能快速有效地鉴别药物新靶点，RNAi 文库的应用将为肿瘤和感染性疾病等的发病机制和治疗研究提供理论依据和新的切入点。

2.2.2RNA干扰辅助药物靶点的确证高通量筛选技术可以发现和某种疾病相关的药物靶点库，然而要完全确定某蛋白在某种疾病中的重要性或某种蛋白在某种药物发挥药效中的作用，要看在动物模型内阻断候选基因是否能减缓病症或拮抗药物原有的药理活性，甚至在人体内验证。鉴于近来向活体中转染siRNA 技术的不断提高，在动物模型中的应用也取得进展，于是利用RNAi 阻断模拟人疾病状态的动物模型中的基因的表达，对靶点进行深入的鉴定和评价呈现出潜在的优势。Brummelkamp 等[16]通过逆转录病毒载体介导的shRNA 表达系统靶向K-rasV12 的mRNA，转染人胰腺癌细胞，结果验证了K-rasV12 是胰腺癌中一个很好的抗肿瘤药物靶点，同时也说明RNAi 可以验证药物筛选中候选靶点在活体内的功能，为鉴定候选靶点最终是否能作为新药靶提供了有力的证据。

3蛋白水平的药物靶标

发现与验证人类基因组计划大规模测序为创新药物的研究提供了前所未有的机遇，但是生命活动是通过DNA 到RNA 到蛋白质来实现的。药物作用的基础也是蛋白质而非 RNA/ DNA [17]。蛋白水平的药物靶标研究具有更加重大的意义。迄今，已发现的大部分药物靶标都是来自蛋白水平研究。蛋白水平药物靶标的研究方法也是层出不穷，人们不仅通过蛋白质组学[18， 19]、蛋白芯片[20]、噬菌体展示[21， 22]等技术大规模筛选药物靶标，而且还利用亲和色谱[23～25]、酵母三杂交系统[26，27]、磁性纳米探针技术[28]等发现了很多天然活性化合物或其衍生物的作用靶点。

3.1亲和色谱技术在药物靶标研究的漫长发展历程中，亲和色谱技术是最经典的一种技术。由于它具有能直接分离各种组织、细胞中的天然状态蛋白、操作方便、稳定性强等优点，长期以来被广泛应用于药物靶蛋白的分离。迄今为止，亲和色谱法已成功应用于FK506[23]、环孢菌素[24]等多种药物靶蛋白的搜寻。常用的亲和色谱法包括固相洗脱、药物竞争法等，如果亲和柱(柱材——药物)与靶蛋白解离过慢，则很难洗脱下来，须制备无活性结构类似药物的对照柱;如果药物溶解性差，蛋白会随不溶的药物沉淀，则无效。2006-05报道的一种称为“系列亲和色谱法”的改良亲和色谱法，则不受药物溶解性、配基-蛋白复合物解离速度的影响，适合于溶解性较差的化合物，该方法已经甲氨喋呤、FK506 等药物的靶点寻找上得到了验证[25]。作者也采用系列亲和色谱法首次发现了麦冬活性成分——鲁斯可皂苷元的特异性结合蛋白(另文发表)。

3.2噬菌体展示技术噬菌体展示技术是一种有效的药物靶点筛选工具，它可以将外源蛋白或多肽呈现在噬菌体表面，利用外源蛋白或多肽与待筛选药物的特异性亲和作用，通过吸附-洗脱-扩增的筛选富集过程，将表达与药物特异性结合的外源蛋白或多肽的噬菌体大量富集，然后通过测序分析即可得到与药物特异性结合的外源蛋白或多肽。这一技术将基因型和表型、分子结合活性和噬菌体的可扩增性巧妙的结合起来，是一种高效的筛选体系，同时也是一种探讨受体和配体之间相互作用的结合位点、寻求高亲合力结合配体的有力工具。据报道，Rodi[21]等利用噬菌体展示技术，对抗癌药物紫杉醇进行筛选，获得了紫杉醇在体内的药物作用的靶点Bcl-2 蛋白。Jin[22]等利用噬菌体展示技术，通过固定化阿霉素筛选T7噬菌体人类肝脏的cDNA 文库，得到了阿霉素的靶点蛋白hNopp140。

3.3三杂交系统三杂交系统(three-hybrid system)是近几年在酵母双杂交技术的基础上发展的由活性小分子鉴定靶蛋白的方法。其基本原理与酵母双杂交类似，只是在“钩”与“鱼”之间加了“饵”构成三杂交中的3个组分：其中的“饵”是一种修饰过的活性小分子，是由活性小分子和配体A 连接而成：“钩”是由配体A 的受体蛋白与DB 融合而成;“鱼”是由cDNA 库中的蛋白融合在AD 上构成。当待筛选靶组织的cDNA 库中的某一蛋白与小分子相互作用时报告基因的转录被启动，这时细胞可被明显检测。Becker 等用周期素依赖性蛋白激酶(CDK)抑制剂作为饵，采用该方法从人cDNA 库中筛选到多种CDK抑制剂的靶蛋白[26]。此外，在哺乳动物组织细胞中采用三杂交系统筛选活性小分子的靶蛋白也已获得成功[27]。

3.4蛋白芯片技术蛋白质芯片是一种类似于基因芯片的高通量筛选方法。利用蛋白质芯片技术可以从正常细胞和病变细胞的蛋白质的变化中发现疾病相关蛋白，这些相关蛋白经研究筛选后可能成为药物的新靶点。Fong 等[20]借助蛋白质芯片发现TROP2 将成为口腔鳞状上皮细胞癌的诊断治疗和抗口腔鳞状上皮细胞癌药物研究的新靶点。

4展望

虽然目前确定的药物靶点还很少，药物靶标的发现与验证的各种方法也存在种种不足，毫无疑问人类基因组框架图的绘制完成，功能基因组研究的深入，为发现更多药物靶标提供了可能，这将有利于药物发现和开发的进程。同时，生命科学与化学、物理学、信息学等其他学科进一步的交融，将为各种技术方法不断发展完善奠定基础。相信随着功能基因组研究的深入及生物技术的快速发展，人类将能够更加明确地阐明疾病的病理生理机制、药物治疗作用及其毒性作用的分子机制，发现更多可以治疗疾病的药物作用靶点或靶点组合，进而发现更好的药物，提高人类的生活质量。