莪术微乳凝胶药代动力学研究

作者：钟华，尹蓉莉，高剑坤，周淑芳，赵启鹏，文登福，江洪波，田仁君

【摘要】 目的建立HPLC 检测家兔血浆中牻牛儿酮浓度的方法。方法运用HPLC研究并比较了经皮给药以及注射给药后牻牛儿酮在家兔体内的药物动力学过程。结果其中经皮给药Tmax为(7.333±1.633)h，Cmax为(100.233±53.360)ng/ml，t1/2为(10.209±2.393)h，而注射给药后， Tmax为0 h后，Cmax为(273.45±137.189)ng/ml，t1/2为(14.867±10.138)h。结论经皮给药药物代谢较完全，与注射给药相比，具有毒副作用小，且能达到持效、长效的目的。

【关键词】 莪术微乳凝胶; 经皮给药系统; 注射给药; 药代动力学

莪术作为传统中药具有活血化瘀的功效， 现代研究表明，其活性成分对皮肤癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、直肠癌等等都有一定程度的治疗以及辅助治疗作用，可以改善血液流变学参数以及增强在体对病毒性感染的抵抗能力，起到对实体肿瘤以及病毒性感染的治疗以及辅助治疗作用[1]。莪术微乳凝胶是将莪术微乳作为中间体形式制成水凝胶剂，该剂型集中了微乳对药物的彻底分散性，凝胶对皮肤的粘合性以及润湿性，使药物直接持续地发挥药效，增强了制剂的疗效、稳定性和靶向性、减小了其毒副作用，使药物以恒定速度 (或接近恒定速度)通过皮肤各层或黏膜，产生全身或局部治疗作用，尤其适宜于皮肤癌的治疗。本实验运用HPLC法研究并比较了经皮给药以及注射给药后牻牛儿酮在家兔体内的药物动力学过程，为莪术微乳凝胶的临床应用提供参考依据[2～4]。

1 仪器与试药

莪术微乳凝胶(自制)，牻牛儿酮对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号111665-2000401);乙腈为色谱纯，水为超纯水，三氯醋酸、异丙醇、正丁醇、无水硫酸钠为分析纯，其余试剂均为分析纯。家兔6只，体质量(2.5±0.5)kg，实验动物中心提供。LC-10ATVAP型高效液相色谱仪，Prostar 325型二极管阵列检测器。micromax高速离心机(美国热电)。

2 方法与结果

2.1 血浆样品的高效液相检测方法

2.1.1 沉淀剂的制备称取三氯醋酸10 g，加到100 ml异丙醇正丁醇溶液(5∶1)中，振荡使溶解，得到血浆蛋白沉淀剂。

2.1.2 血浆样品预处理家兔耳缘静脉取血2ml，置于预先加入肝素抗凝的10 ml离心管中，3 000 r·min-1离心10 min，分离血浆。取血浆500 μl置于10 ml离心管中，旋涡混合10 s，加入沉淀剂150 μl，旋涡混合30 s，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液置于另一离心管中，加入无水硫酸钠100 mg，旋涡混合1min，使硫酸钠溶解，3 000 r·min-1离心5 min，吸取上层澄清液，取20 μl进样测定。

2.1.3 高效液相分析条件色谱柱为HypersilCN(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-水(40∶60);流速1.0 ml/min ;检测波长210 mm;进样20 μl;温度35℃。典型色谱图：在上述条件下测得空白血浆、空白血浆加入实验标准品、实验采集血浆样品的典型色谱图1。最低检测限和最低定量限的测定：通过测定，牻牛儿酮的最低检测限和最低定量限的测定分别1 ng/ml和10 ng/ml。图1 药代动力学HPLC图

2.2 标准曲线的制备

2.2.1 牻牛儿酮标准溶液的配制精密称取牻牛儿酮标准品10.0 mg，置于10 ml容量瓶中，加异丙醇溶解定溶，得浓度为1 mg/ml的标准液储备液。精密吸取储备液于10 ml容量瓶中，分别配制成浓度为50，5，0.5 μg/ml的标准液。

2.2.2 牻牛儿酮血浆标准曲线的制备取空白血浆0.5 ml，加入牻牛儿酮标准液适量，制备成浓度分别为10，20，50，100，500，1000 ng/ml的标准血浆样品，按样品处理方法项下进行处理测定，计算牻牛儿酮峰面积，以牻牛儿酮的血药浓度进行线性回归，得药物血浆曲线方程。本方法测定血浆中牻牛儿酮的最低检测限为0.63 ng·ml-1，最低检测浓度为1 ng/ml，最低定量限为10 ng/ml，标准曲线见表1，图2。其血药浓度标准曲线方程为：Y= 60.91X + 4 155.1 (r=0.999 0，n=6)。表明牻牛儿酮在血浆中浓度10～10 000 ng·ml-1范围内线性良好。

2.2.3 分析方法的专属性所测物质牻牛儿酮在上述色谱条件下保留时间适当，血浆内源性物质及所用试剂在待测峰附近无干扰峰产生，满足待测药物的体内含量测定的条件，该分析方法的专属性良好。

2.2.4 分析方法回收率配置浓度为50 ，500，1 000 ng·ml-1的牻牛儿酮标准溶液，与对应浓度的血浆样品进行比较，求出绝对回收率。结果见表2。表1 牻牛儿酮血浆浓度线性与范围图2 血药浓度标准曲线图表2 分析方法回收

2.2.5 绝对回收率 配制浓度为50，500，1 000 ng·ml-1的低、中、高3种牻牛儿酮标准血浆样品，按上述血浆样品预处理步骤操作，血浆样品中牻牛儿酮色谱峰面积代入标准曲线，通过测得浓度与理论浓度的比值求得相对回收率。结果见表3。表3 样品绝对回收率

2.2.6 分析方法精密度配制浓度为50 ，500，1 000 ng·ml-1的低、中、高三种牻牛儿酮标准血浆样品，按上述血浆样品预处理步骤操作，同日内及日间分批测定，计算日内和日间相对标准差，结果见表4，精密度达到要求。表4 日内日间精密度测定

2.3 莪术微乳凝胶药物动力学研究

2.3.1 实验设计及取样方法取家兔6只，随机分成两个实验组，每组3只。实验前1 d小心剃去腹部皮毛(10 cm×10 cm)，注意不要损伤皮肤，禁食一夜，自由饮水。莪术微乳凝胶经皮给药方案及血样采集：按一定剂量经皮给药，将凝胶贴敷于家兔皮肤上，于给药后0.5，1，2，4，6，8，10，14，18 ，24 h从家兔耳缘静脉取血2 ml至预先加入肝素抗的离心管中，3 000 r/min离心10 min取血浆冰冻保存待测，按样品处理项下方法进行处理测定。得血药数据，表3～5。莪术微乳注射给药方案及血样采集：于耳缘静脉按一定剂量注射莪术微乳，于给药后0.0，0.5，1，2，4，6，8，10，14，18 ，24 h另侧耳缘静脉取血2ml至预先加入肝素抗的离心管中，3 000 r/min离心10 min取血浆冰冻保存待测，按样品处理项下方法进行处理测定。得血药数据。

2.3.2 数据处理单剂量对家兔经皮给药后血药浓度见表5、图3，单剂量对家兔注射给药后血药浓度见表6，图4。所测数据用3P97药动学数据处理软件进行处理，得其动力学参数见表7～8。表5 单剂量对家兔经皮给药后不同时间的血药浓度图3 单剂量经皮给药血药浓度图表6 单剂量对家兔注射给药后不同时间的血药浓度图4 单剂量注射给药血药浓度图表7 单剂量对家兔经皮给药动力学参数表8 单剂量对家兔注射给药动力学参数

3 结果

从实验结果可见，莪术微乳凝胶经皮给药及注射给药在家兔体内均为二室模型，其中经皮给药Tmax为(7.333±1.633) h，Cmax为(100.233±53.360) ng/ml，t1/2为(10.209±2.393) h，而注射给药后， Tmax为0 h后，Cmax为(273.45±137.189)ng/ml，t1/2为(14.867±10.138) h。莪术微乳凝胶的达峰时间(Tmax)较长，达峰浓度(Cmax)较高，消除半衰期(t1/2)较短，与注射给药相比，经皮给药药物代谢较完全，具有毒副作用小，且能达到持效、长效的目的。