大鼠体内泻心汤及其不同配伍黄酮类成分药代动力学的变化规律研究

作者：周慧，马越鸣石荣，闫晶超

【摘要】 目的研究泻心汤不同配伍黄酮类成分在大鼠体内药代动力学的差异。方法大鼠随机分为4组，分别灌胃给予泻心汤(XXD)，单味黄芩(RS)，大黄+黄芩(RRR+RS)和黄连+黄芩(CC+RS)，给药前及给药后不同时间采集血样，HPLC法测定黄芩苷和汉黄芩苷浓度，由血药浓度-时间数据计算药动学参数，比较组间差异。结果与RS组相比，其余3组中黄芩苷的AUC和Cmax数值均有不同程度的降低;而CC+RS组中汉黄芩苷的AUC和Cmax数值与RS组相比亦有明显减少。结论泻心汤配伍(黄连和大黄)可能使黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷的吸收减少、暴露水平降低，其中黄连的影响更明显。

【关键词】 泻心汤; 黄酮类; 配伍; 药代动力学

Abstract：ObjectiveTo investigate the pharmacokinetic profile of the baicalin and wogonoside in rats after oral administration of Xiexin Decoction (XXD)and the different combinations of its constituent herbs. MethodsRats were pided into four groups and were randomly administered one of the four aquous extracts: RS， RS + RRR， RS+CC and XXD (RS+RRR+CC) via intragastric gavage. Plasma concentrations of Baicalin and wogonoside were measured by HPLC. Pharmacokinetic parameters were calculated from the plasma concentration-time data.ResultsThe Cmax and AUC of baicalin and wogonoside were significantly different among the four groups. Compared with the group of RS alone， the rest three groups， RS+CC， RS + RRR and RS+RRR+CC (XXD)， showed a decrease in AUC and Cmax of the baicalin and RS+CC group showed a decrease in the AUC and Cmax of wogonoside.ConclusionThe results suggested that CC and RRR may markedly decrease the absorption and systematic exposure levels of baicalin and wogonoside in RS， and CC has more profound effect.

Key words： Xiexin Decoction; Flavonoids; Compatibility; Pharmacokinetics

泻心汤(Xiexin Decoction)为出自《金匮要略》的清热经典名方，由大黄、黄芩、黄连组成，具有抗炎[1]、抗病原微生物、抗凝、改善高血压及高脂血症、保护胃黏膜等药理作用[2]。关于泻心汤配伍成分的研究报道有很多，如应用HPLC测定黄芩苷-小檗碱沉淀物在不同条件下的平衡浓度[3]等。但是在泻心汤不同配伍中黄酮成分的药代动力学研究未见报道。

黄芩(Radix Scutellariae)为唇形科植物黄芩Scutellria baicalensis Georgi.的干燥根。味苦，性寒，具有清热燥湿，泻火解毒之功效。黄芩有效成分为黄酮类，主要包括黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、汉黄芩苷(wogonoside)、汉黄芩素(wogonin)等(图1)。文献报道，黄芩苷由于极性大不能直接跨膜转运吸收入血，而是在肠道菌群的葡萄糖醛酸苷酶作用下转化为其苷元即黄芩素，黄芩素进入肠黏膜后，在UDPG-葡萄糖醛酸转移酶的作用下转化为黄芩素-葡萄糖醛酸结合物(恰好与原型黄芩苷结构一致)，再主要以黄芩苷的形式经肠道吸收入血，进入血液的黄芩素还可在肝脏经UDPG-葡萄糖醛酸转移酶转化生成黄芩素-葡萄糖醛酸结合物(即黄芩苷)[4～8]。体内的黄芩苷又可经胆汁和肠黏膜[9，10]转运至肠腔，经历再循环过程。由于黄芩苷的这种吸收和代谢特性，当大鼠灌胃给予黄芩苷或黄芩素时，通常在血浆里能够迅速检测到黄芩苷，而黄芩素的浓度很低或无法检测到[11，12]。汉黄芩苷的体内转化过程与黄芩苷类似[13]。由此可见，大鼠灌胃给予黄芩提取物后，进入体循环的主要是黄芩苷和汉黄芩苷。因此，本实验研究泻心汤及其不同配伍在大鼠体内黄芩苷和汉黄芩苷的血药动力学变化规律。

1 仪器与材料

1.1 仪器Agilent HP1100高效液相色谱仪系统：配有二元泵、DAD检测器、自动进样器和色谱工作站;XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);USC-502超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司);FA2004N分析天平(上海精密科学有限公司);TGL-16G-A型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 药品及配制黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素标准对照品：购于中国药品生物制品检定所;对羟基苯甲酸甲酯标准对照品，购于国药集团，甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂为分析纯，实验用水为三蒸水。

大黄，黄芩和黄连，购自上海康桥中药饮片有限公司，经本校生药教研室赵志礼教授鉴定，按2∶1∶1比例，传统方法煎煮，标准化制备过程制成泻心汤和各不同配伍组提取物细粉，由本校科技实验中心中药制药室制备。各提取物中活性成分及含量用HPLC法分析测定[14]。

1.3 动物SD大鼠，250～280 g，雌雄各半，合格证号：SYXK(沪) 2004-2005，由本校实验动物中心提供。实验前禁食12h，自由饮水。

2 方法

2.1 色谱条件色谱柱为SUPELCO Discovery C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);流动相为2%甲酸0.1%三乙胺-乙腈(77∶23，V∶V);流速1.0 ml·min-1;柱温25℃;检测波长277，318 nm;进样体积50 μl。

2.2 样品预处理取血浆0.1 ml，加入内标18 μg/ml对羟基苯甲酸甲酯10 μl，加入1 mmol·L-1KH2PO4溶液50 μl，振荡混匀;加入甲醇∶乙腈(1∶1)100 μl，36%乙酸5 μl涡漩10 min，离心(16 000 r·min-1)20 min，取上清液进行分析。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性血浆色谱图(图2)表明，空白血浆在与对照品相同保留时间处没有检出色谱峰，黄酮类成分与其它成分达到基线分离，说明血浆中内源性物质、代谢产物及泻心汤中其它成分均不干扰黄酮类成分的检出。

2.3.2 线性范围及定量限制备黄芩苷、汉黄芩苷浓度分别为0，0.1，0.5，2.0，5.0，7.0，10.0 mg·L-1及0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mg·L-1血浆样品，按“2.2项”下血浆样品预处理的方法操作，用样品浓度X对样品与内标峰面积比Y作直线回归，得黄芩苷标准曲线回归方程Y= 0.458X+0.017 95(r= 0.998 4， n= 5);汉黄芩苷标准曲线回归方程Y= 0.885X+0.045 97(r= 0.996 8， n= 5)。黄芩苷和汉黄芩苷血浆浓度分别在0.1～10.0 mg·L-1及0.1～8.0 mg·L-1范围内线性良好，定量下限(LLOQ)均为0.1 mg·L-1。

2.3.3 精密度、准确度与回收率制备黄芩苷浓度为0.1，5.0，10.0 mg·L-1和汉黄芩苷浓度为0.2，1.0，8.0 mg·L-1血浆样品，按“2.3.2”项下操作，批内平行5份，用于评价方法的准确度和批内精密度，连续测定3 d，计算批间精密度。低、中、高3个浓度的准确度(n=5)黄芩苷为92.6%，93.1%和92.0%;汉黄芩苷为117.7%，103.6%和91.0%。3个浓度的批内精密度(n= 5)黄芩苷为4.1%，8.2%和1.6%;汉黄芩苷为16.9%，5.8%和12.7%，批间精密度(n=5)黄芩苷为4.2%，1.5%和1.7%;汉黄芩苷为7.4%，3.9%和2.2%。另取超纯水加入黄芩苷和汉黄芩苷，使其浓度与血浆样品相同，按 “2.2”项下血浆样品的预处理操作，得标准样品峰面积比，求得低、中、高3个浓度血浆提取回收率(n=5)黄芩苷为58.5%，81.4%和68.8%;汉黄芩苷为84.2%，80.9%和76.0%。

2.3.4 稳定性配制与“2.3.3”项浓度相同的黄芩苷、汉黄芩苷血浆样品，在- 70 ℃条件下存放 3 d，室温放置20 h，冻融1次。按照“2.2”项下预处理操作，结果在以上条件下各浓度样品测定值的RSD均小于15%，这表明在此条件下黄酮类成分稳定性良好。血浆样本按此条件保存及测定。

2.3.5 方法学质控在生物样本分析方法确证完成以后开始测定未知样品，同时进行质量控制。每个分析批生物样品测定随行标准曲线，并进行3浓度双样本质控样品分析，并将质控样品变异<15%作为当日数据是否接受的标准。

2.4 泻心汤不同配伍中黄酮类成分(黄芩苷、汉黄芩苷)在大鼠体内的药代动力学实验SD大鼠28只，雌雄各半，随机分成4组，每组7只，分别灌服泻心汤、单味黄芩、大黄+黄芩以及黄芩+黄连提取物水溶液(各组给药剂量及活性成分含量见表1)。本实验中泻心汤的给药剂量为12 g(生药)·kg-1，与大鼠灌服泻心汤的有效剂量相同[15]，为人用等效剂量的2倍[16]。各组分别于给药前及给药后5，10，20 min及0.5，1，2，4，6，8，12，16，24，28，32 h于眼球后静脉丛采血，肝素抗凝9 600 r·min-1离心制备血浆，吸取血浆，-20℃保存，按照上述方法测定，由随行标准曲线计算出黄芩苷、汉黄芩苷的血药浓度。

a.标准品;b.空白血浆;c.空白血浆+标准对照品;d～f：给药后10 min血浆[给予黄芩(d)、泻心汤(e)、黄芩+大黄(f)和黄芩+黄连(g)]

2.5 数据分析各组大鼠给药后血浆色谱图与泻心汤及空白血浆色谱图进行对比，并通过与黄酮类成分(黄芩苷、汉黄芩苷)标准对照品进行对比确认，分析给药后血浆中黄酮类成分。

黄芩苷、汉黄芩苷的血药浓度-时间数据采用非房室模型， DAS 2.0程序进行药代动力学分析，用统计矩法求算药代动力学参数。采用梯形法计算AUC0-t;AUC0-∞ = AUC0-t + Ct/ke，其中Ct为最末点的血药浓度。数据以±s表示，各组动力学参数间的差异用方差分析统计学检验。

3 结果

各组大鼠分别灌服泻心汤、单味黄芩、大黄黄芩以及黄芩黄连后，血浆中可检测到的黄酮类成分主要为黄芩苷、汉黄芩苷(图2)，其对应的苷元黄芩素、汉黄芩素均未检测到。黄芩苷、汉黄芩苷的平均血药浓度-时间曲线见图3。

结果表明黄芩苷、汉黄芩苷可迅速吸收进入体内，5 min即可检测到。并随时间呈动态变化，药时曲线呈现双峰现象。在4个给药组中，黄芩苷在体内的血药浓度均高于汉黄芩苷。在泻心汤中和其他黄芩配伍中，黄芩苷分别在给药后28 h和32 h后血药浓度降至定量限下;而在黄芩+黄连组和其他3组中，汉黄芩苷分别在给药后28 h和32 h后血药浓度降至定量限下。

黄芩苷和汉黄芩苷的药代动力学参数见表2～3。两者的Cmax 和 AUC组间差异明显(P<0.05或 P< 0.01)。与单味黄芩组相比，其余3组(黄芩+大黄、黄芩+黄连、泻心汤)中黄芩苷的AUC数值显著降低，分别相当于黄芩组AUC的52.6%， 42.9%和41.4%，其余3组Cmax1也明显降低;且黄芩+黄连组和泻心汤组中黄芩苷的Cmax也显著降低;黄芩配伍黄连后，汉黄芩苷的Cmax 和 AUC明显减小。与黄芩+黄连组相比，泻心汤组的黄芩苷和汉黄芩苷的Cmax1均有所升高。表2 大鼠口服泻心汤等的黄芩苷药代动力学参数与RS组比较，aP< 0.05， bP< 0.01; 与RS+CC组比较，cP< 0.05表3 大鼠口服泻心汤等的汉黄芩苷药代动力学参数与RS组比较，aP< 0.05， bP< 0.01; 与RS+CC组比较，cP< 0.05

4 讨论

文献报道，黄芩提取物中黄芩苷的药时曲线与药代动力学参数与灌胃给予黄芩苷纯品一致。这表明黄芩自身成分对黄芩苷和汉黄芩苷的药代动力学特征没有影响[17]。本研究中着重研究配伍对于泻心汤中黄酮类成分药代动力学参数的影响。结果表明，黄芩伍用黄连后，黄芩苷的药代动力学参数(Cmax1， Cmax2 和 AUC(0-∞))以及汉黄芩苷的药代动力学参数(Cmax1 and AUC(0-∞))的数值显著减少。该结果提示，配伍黄连使得两者的生物利用度下降。黄连使黄芩苷和汉黄芩苷吸收减少的可能原因如下：

在黄酮类成分的吸收过程中，肠道菌群起着重要的作用，其活性直接影响着黄酮类成分的生物利用度。黄连的有效成分主要为小檗碱(berberine)，药理研究表明，小檗碱有较强的抗菌作用[18]，故推测黄连的抗菌作用抑制了肠道菌群的活性，使黄芩苷水解成黄芩素减少，黄芩素跨膜减少，从而使黄芩苷吸收减少。

另据文献报道，黄连与黄芩复方煎出液可产生沉淀，且复方煎出液中黄连生物碱和黄芩中黄酮化合物的含量均有不同程度下降。产生沉淀的原因是由于黄连中含有原小檗碱型生物碱为碱性化合物与黄芩中含有多酚类化合物黄芩苷等酸性化合物相互结合，生成分子量较大的水不溶物[19]。有研究表明[20]，泻心汤煎煮过程中产生的沉淀物在人工胃液和肠液中只能部分解离，释放出活性成分黄芩苷和小檗碱。因此大鼠灌胃泻心汤后，在肠道中很有可能存在未溶解的沉淀物，使黄芩苷吸收减少。

本研究结果还表明，大黄也可使黄芩苷吸收减少，其机理有待进一步研究阐明。