罗红霉素胶囊在人体的药代动力学及生物等效性

作者：尤海生，董亚琳，王茂义，董卫华，郑鑫

【摘要】 目的 建立人血浆中罗红霉素浓度的高效液相分析方法，用于研究罗红霉素胶囊在人体的药代动力学和生物等效性。方法 血浆样品采用己烷异戊醇(98∶2)液液萃取，反相高效液相法测定。结果 罗红霉素的线性范围为0.25-32.06mg/L(r为0.9992)，最低检出质量浓度为0.25mg/L，最低检出量为12.5ng，提取回收率为68.0%-72.8%，方法回收率为90.7%-99.4%。单次服用300mg罗红霉素胶囊受试制剂或参比制剂后的药动学参数AUC0-48h、Cmax、tmax、t1/2分别为(101.84±27.69)(mg·h)/L和(103.5±30.83)(mg·h)/L，(8.54±1.95)mg/L和(8.07±1.81)mg/L，(1.6±0.6)h和(1.8±0.6)h，(10.4±2.9)h和(10.5±2.6)h。受试制剂相对生物利用度为(100.5±19.1)%。结论 该方法专一性较好，血浆内源性杂质无干扰，结果准确。罗红霉素的两种制剂间主要药动学参数无明显差异，具有生物等效性。

【关键词】 罗红霉素；HPLC；生物等效性；药代动力学

Pharmacokinetics and bioequivalence of roxithromycin capsules in human

ABSTRACT: Objective To establish the method of assaying roxithromycin in human plasma by high performance liquid chromatography (HPLC)， and to study its pharmacokinetics and bioequivalence. Methods The plasma samples were extracted by hexane isoamylalcohol (98∶2) and reversed phase chromatography to determine the concentration of roxithromycin. Results The calibration curve was linear from 0.25mg/L to 32.06mg/L， the minimum concentration was 0.25mg/L(r=0.9992) and the minimum quantitation was 12.5ng. The extraction recovery rate was 68.0%-72.8% and the method recovery rate was 90.7%-99.4%. After a single oral dose of 300mg roxithromycin test or reference capsules， the main pharmacokinetic parameters were as follows: AUC0-48h(101.84±27.69)(mg·h)/L and (103.5±30.83)(mg·h)/L， Cmax(8.54±1.95)mg/L and (8.07±1.81)mg/L， tmax(1.6±0.6)h and (1.8±0.6)h， t1/2(10.4±2.9)h and (10.5±2.6)h， respectively. Relative bioavailability of the test fomulation was (100.5±19.1)%. Conclusion This method can be used in the analysis of roxithromycin in the plasma without endogenic substance interference. The method is specific and accurate. No significance difference exists among the main pharmacokinetic parameters for the test capsules and the reference capsules. The two formulations are bioequivalent.

KEY WORDS: roxithromycin; high performance liquid chromatography (HPLC); bioequivalence; pharmacokinetics

罗红霉素是半合成的十四元大环内酯类抗生素，具有口服吸收好、半衰期长等特点。在较低波长处，罗红霉素具有较高的吸收，可采取分光光度方法检测。本实验采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography， HPLC)测定血浆中罗红霉素的含量，最低检测浓度为0.25mg/L，可满足罗红霉素药动学的研究。此方法简便迅速，结果准确。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器 受试制剂：罗红霉素胶囊(T)，规格：150mg/粒，批号：030701，山东天顺药业股份有限公司生产。参比制剂：罗红霉素胶囊(R)，规格：150mg/粒，批号：03121202，江苏扬子江药业集团有限公司。罗红霉素对照品含量946u/mg，批号：30351-200303，由中国药品生物制品检定所提供。试剂：甲醇由美国Fishers公司生产，色谱纯；正己烷由德国Merck公司生产，色谱纯；异戊醇以及其余试剂均为分析纯，异戊醇用前经重蒸馏；水为超纯水。仪器： 美国Waters公司高效液相色谱仪，包括486可变紫外检测器，510型高压泵，7725I型进样阀，AS938色谱工作站；TDL40B台式高速离心机。

1.2 受试对象 20名男性健康志愿者，年龄(24±2.8)岁，身高(173±4.9)cm，体重(64±5.8)kg。肝、肾功(GPT、GOT、BUN、CR)、心电图、血糖、血压、血常规试验前检测均正常。受试者试验前两周至试验结束未服用其他药物，受试期间忌烟、酒和含咖啡因的饮料。试验期间统一食谱，试验前签署知情同意书。试验方案获院伦理委员会批准。

1.3 色谱条件 色谱柱：Hypersil柱(250mm×4.6mm，5μm)，美国热电公司提供；流动相：甲醇15mmol/L磷酸二氢钾=70∶30(氨水调pH=6)；流速：0.7mL/min；检测波长：220nm；进样量：50μL；柱温：60℃。

1.4 给药方案及血浆样品的采集与处理 实验采用单剂量双周期交叉实验设计，受试者随机分为两组，分别单剂量口服受试制剂和参比制剂，剂量均为每人300mg，受试者用药前12h及用药后4h内禁食，实验期间统一进餐。间隔一周清洗期后再交叉。受试者于给药前及给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48h取静脉血4mL置肝素化试管中，3000r/min离心10min，分离血浆，-20℃冰箱冻存待测。 吸取血浆样品1mL于10mL带塞试管中，加入0.1mL 1mol/L NaOH溶液，涡旋混匀后放置5min，加入4mL正己烷与异戊醇的混合液(正己烷∶异戊醇=98∶2)，涡旋混匀2min，2500r/min离心5min，移去上层有机溶液，45℃水浴下氮气流吹干，残渣加100μL流动相溶解，取50μL进入HPLC分析。

1.5 数据处理 所得血药浓度时间数据用3P97药动学软件计算药动学参数，经统计矩计算得AUC0-t，AUC0-∞，MRT及t1/2。按公式t1/2=0.693/ke计算ke，Cmax和tmax为实测值，用3P97药动学软件进行生物等效性分析。两制剂的AUC，Cmax 经对数转换后进行方差分析、双单侧t检验，并计算90%的可信区间。tmax进行Wilcoxon检验。 相对生物利用度(F)=AUC试验药/AUC参比药×100%

2 结果

2.1 方法的专属性 在已建立的色谱条件下，测得空白血浆、标准血浆、受试者血浆的色谱图。由图1可见血浆中的内源性杂质不干扰罗红霉素的测定。罗红霉素的保留时间为9.5min。

2.2 标准曲线的制备及定量下限 取正常人空白血浆1mL，精密加入不同量的罗红霉素的标准品溶液，配制质量浓度为32.06、16.03、8.02、4.01、2.01、1.00、0.50、0.25mg/L的系列标准血浆样品，按“血浆样品”的处理与测定方法操作。以罗红霉素峰面积(y)对浓度(x)回归，得标准曲线方程为：y=295.6+42874.1x，r=0.9992(n=6)，在(0.25-32.06)mg/L范围内线性良好，罗红霉素在血浆中的定量下限(S/N=3)为0.25mg/L，最低检出量为12.5ng。

图1 血浆中罗红霉素的HPLC图（略）

Fig.1 HPLC chromatograms of roxithromycin in human plasma

A: blank plasma; B: blank plasma with roxithromycin (4.408mg/L); C: subject plasma sample 2.0h after oral administration

2.3 回收率的考察结果 取空白血浆加入罗红霉素对照液配成的16.548、4.408、0.547mg/L样品各5份，按“血浆样品”的处理与测定方法操作，测定其含量，再与加入量相比即为相对回收率。以3个浓度对应相同的进样量的对照品进行分析，计算血浆样品的绝对回收率，结果见表1。

表1 人血浆中罗红霉素的回收率的测定结果（略）

Table 1 The recovery of roxithromycin in human plasma

2.4 精密度的考察结果 取空白血浆加入罗红霉素标准液配成的16.548、4.408、0.547mg/L三个样品各5份，按血浆样品的处理与测定方法操作，于同日不同时间测定和不同日内重复测定，计算日内、日间精密度，结果见表2。

表2 人血浆中罗红霉素的精密度的测定结果（略）

Table 2 The precision of roxithromycin in human plasma

2.5 血浆稳定性的考察结果 取1mL空白血浆若干份，加入罗红霉素标准液配成的浓度为15.960、4.409、0.547mg/L的标准血浆样品。分别对室温放置稳定性(12h)、冻融稳定性(反复冻融2次)、长期冷冻稳定性(-20℃保存3周)以及血浆样品处理后流动相复溶稳定性(室温放置12h)进行考察，结果表明罗红霉素标准血浆样品室温放置12h、反复冻融2次、冷冻保存3周后显示稳定，血浆样品处理后流动相复溶室温放置12h显示稳定。

2.6 罗红霉素药动学和生物等效性的研究 20名受试者单剂量口服罗红霉素受试制剂或参比制剂300mg后，药时曲线见图2。主要药动学参数见表3。单剂量口服罗红霉素受试药和参比药的lgAUC0-∞、lgAUC0-t进行三因素方差分析，结果表明二者试验制剂间、周期间、个体间差异均无显著性(P>0.05)；进一步进行双单侧t检验及(1-2α)置信区间分析，以80%-125%为等效标准，结果判定均具有生物等效性(表4)。受试制剂的相对生物利用度F0-t为(100.3±19.1)%；F0-∞为(100.5±19.6)%。

图2 20例志愿者服用罗红霉素后的平均血药质量浓度的经时曲线（略）

Fig.2 Mean plasma concentrationtime curves of roxithromycin after a single oral dose of 300mg in 20 healthy volunteers 表3 20名健康受试者口服罗红霉素300mg后的药动学参数（略）

Table 3 Pharmacokinetic parameters of roxithromycin after a single oral dose of 300mg in 20 healthy volunteers

表4 罗红霉素的生物等效性分析（略）

Table 4 The bioequivalant statistical analysis of roxithromycin 3 讨论 罗红霉素的测定方法有抗生素微生物检定法[13]、HPLCCED法[45]、HPLCMS法[67]和HPLCUV法[810]。HPLCUV法具有定量快速、精确的特点，方法明显优于微生物效价测定法。本试验采用了反相高效液相法测定血浆中的罗红霉素的浓度，具有较高的选择性。此方法专属性强，精密度、灵敏度较好，能够满足该药的药动学研究的要求。用二氯甲烷或乙醚作为萃取溶媒回收率低，乙醚提取杂质成分较多。在测定血浆罗红霉素浓度的文献[9]中，样品预处理用特殊的固相提取柱提取，其方法操作极其复杂。根据Macek[10]的方法，本文用己烷异戊醇(98∶2)的液液萃取方法提高了回收率，改进了样品提取纯化效果。在220nm波长处检测罗红霉素无杂质干扰峰。 20名健康受试者的自身对照试验表明，受试药罗红霉素胶囊和参比药罗红霉素胶囊在健康人体内的过程基本一致，其主要药动学参数相近，具有生物等效性。受试者在试验过程中未发现严重的不良反应。