冠心丹参注射液药效学研究

【摘要】 目的 观察冠心丹参注射液对健康成年SD大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法 SD大鼠以结扎冠脉30 min再灌注90 min造成心肌缺血再灌注损伤模型，通过观察血流动力学、生物化学和组织学指标，评价大鼠缺血再灌注前冠心丹参片预处对左心室收缩压(LVSP)、左心室发展压(LVDP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室等容期压力最大变化速率(±dp／dtmax)等指标的影响；通过测定再灌注90 min后血中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性和心肌组织病理学观察，对药物保护心肌作用进行评价。结果 表明冠心丹参注射液可有效改善缺血再灌注心脏的缩舒功能；降低缺血再灌注末期血中LDH和CK活性；组织病理学检查表明：与溶剂对照组比较，冠心丹参注射液预处理组能明显减轻心肌组织的损伤。结论 冠心丹参注射液有抗大鼠缺血再灌注引起的心肌损伤作用。

【关键词】 冠心丹参注射液；心肌保护；缺血再灌注

Abstract：Objective To observe the cardioprotective effects of Guanxin Danshen injection on myocardium injury induced by ischemia reperfusion in anesthetized adult SD rats．Methods The myocardial injury of rats induced by ischemia-reperfusion was produced by the ligation of left coronary artery for 30 min followed by 90 min reperfusion．The influence of Guanxin Danshen injection on the changes of biochemistry，histology and hemodynamics，such as LVSP，LVDP ，LVEDP and dp／dtmax，were evaluated．The serum lactate dehydrogenase(LDH) and creatine kinase(CK)activities were assayed by the end of the reperfusion．Results The systolic and diastolic functions were improved，and the serum LDH and CK activities were reduced in Guanxin Danshen injection 100 mg/kg iv group．The histology changes were manifested．The pretreatment of Guanxin Danshen injection alleviated the myocardial damage distinctly，compared with ischemia-reperfusion group．Conclusions The experimental results demonstrate the effects of Guanxin Danshen injection on myocardial injury induced by ischemia-reperfusion in anesthetized rats．

Key words:Danshen Guanxin injection; myocardial protection; ischemia reperfusion

1 冠心丹参注射剂的优点及提取工艺简介

天然植物中有许多活性物质具有抗心肌缺血，缺氧作用，其中一些已开发成治疗冠心病和心绞痛的新药。冠心丹参片的主要成分为丹参，三七，降香油，具有活血化瘀，理气止痛的作用。用于气滞血瘀所致的胸闷，胸痹，心悸气短；冠心病等上述证状者。片剂口服虽然相对安全但起效慢，尤其在治疗一些急症时，凸显出剂型的不足，所以将具有抗心肌缺血，缺氧活性的有效物质制成注射剂无疑是抢救和治疗冠心病和心绞痛等突发疾病的最佳方案。

丹参1 000 g，10倍量水回流提取3次，每次2 h，合并提取液，浓缩至0.2 g生药/mL，用D101大孔吸附树脂处理，先用2 BV注射用水洗脱，然后用3 BV80%乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至0.2 g生药/mL；三七粗粉1 000 g（过40目筛），浸泡40 min，用10倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液浓缩成0.2 g生药/mL，然后吸取提取液用已经预处理好的D101大孔吸附树脂柱处理：先用水洗至流出液不显Molish反应，然后用3 BV70%乙醇洗脱，流速为1.5 mL/min，收集洗脱液浓缩成0.2 g生药/mL；降香饮片1 000 g，加水8 倍量，水蒸汽蒸馏提取11 h收集蒸馏液，冷藏24 h，分去上层油层。

合并上述三液，加注射用水成1 000 mL，加入注射剂用活性炭，用量为0.5%，加热回流30 min，减压抽滤过孔径为0.45 μm的微孔滤膜灌封于2 mL的安瓿中采用流通蒸汽灭菌法灭菌60 min即得。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

Medlab生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司)；动物人工呼吸机(DH—1型，浙江医科大学医疗仪器实验厂)；心电图机(XDH—3B型，上海医用电子仪器厂)。

2.1.2 药品与试剂

冠心丹参片(广州白云山和记黄埔中药有限公司)，乳酸脱氢酶(LDH)测试盒及肌酸激酶(CK)测试盒(南京建成生物工程研究所)，冠心丹参注射液本实验室自制。

2.1.3 动物

昆明种小鼠100只，6～8周龄，雌雄各半，体重18～22 g；健康成年SD大鼠70只，300～350 g，雌雄各半(由辽宁医学院动物实验中心提供)。

2.2 方法

2.2.1 肌缺血再灌注模型制备

大鼠在麻醉下(乌拉坦1.0 g·kg-1，ip)切开颈部皮肤，气管内插管，接人工呼吸机，呼吸频率55～65／min，潮气量1.5～2 mL·100 g-1，呼-吸时比为1.25：1，压力在0.49～1.47 kPa之间。根据呼吸频率及深度调整呼吸参数。分离左、右颈总动脉，左颈总动脉插入一含0.1％肝素生理盐水的PE管，另取一个充满0.1％肝素生理盐水的PE管经右颈总动脉插入左心室，根据显示器所示压力图形改变判断插管是否进人心室腔。两导管均连压力换能器，分别将信号输入到Medlab生物信号采集处理系统，以监测大鼠血压和左心室血流动力学变化。观察指标包括收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室等容期压力最大变化速率(±dp／dt)、左心室舒张压(LVDP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室发展压(LVDP ，系LVSP与LVEDP的差值)、心率(HR)。将针式电极固定于大鼠四肢皮下，以监测肢体Ⅱ导联心电图变化。沿胸骨左缘剪开3，4，5肋骨，暴露心脏，剪开心包膜。以左冠状动脉为标志，用3／8圆3×10不锈钢圆针，在左冠状动脉下穿一4-0丝线。进针深度穿过心肌1 mm左右，进出针问宽度在进出针间宽度在动脉周围1.5～2 mm左右。稳定15 min，待各指标稳定后记录药前心电图及血压等血流动力学各值。将一细小PE管垫于血管与结扎线之间，拉紧结扎线使细小乳胶管压迫左冠状动脉而致闭塞。以结扎后心脏局部发绀伴随T波高耸或ST段抬高，作为结扎成功的标准。结扎30 min后，松开结扎线再灌注90 min，以局部发绀逐渐变为红润、心电图ST段逐渐恢复为再灌注成功的标志。在缺血期及再灌注期每隔15 min记录一次上述指标。每组8只，共4组：假手术组（Sham）、溶剂对照组(IR)、冠心丹参片预处理组(Guanxin Danshen tablet)，冠心丹参注射液预处理组(Guanxin Danshen injection)。假手术组不进行缺血再灌手术，灌胃等容积生理盐水；溶剂对照组进行缺血再灌手术，灌胃等容积生理盐水；冠心丹参片预处理组灌胃冠心丹参片的悬浊液150 mg／kg，第4组为灌胃等容积生理盐水并肌肉注射冠心丹参注射液100 mg /kg，连续给药两周后进行手术。

2.2.2 血清LDH和CK活性测定

各组最后一次血流动力学指标测定后即从左颈总动脉取血约1 mL，2 500 r/min，离心15 min，得到大鼠血清，用LDH测试盒及CK测试盒分别测定。

2.2.3 电镜组织学观察

大鼠心肌缺血再灌注结束后，假手术组（Sham）、溶剂对照组(IR)、冠心丹参片预处理(Guanxin Danshen tablet)、冠心丹参注射剂预处理前(Guanxin Danshen injection)组各取2鼠心脏，用锐利刀片取左室结扎线下与心尖部中点左心室壁小块心肌，体积为2 mm × 2 mm × 2 mm，用4％戊二醛处理，经脱水、包埋、超薄切片，染色后在透射电镜下观察。

2.2.4 冠心丹参注射剂对夹闭小鼠气管心电图消失时间的影响

取小鼠32只，雌雄各半，体重18～22 g，平均体重(19.5±1.2) g，随机分为4组，每组8只，第1组小鼠灌胃等容积生理盐水，第2组灌胃给予冠心丹参片的悬浊液100 mg／kg，第3组小鼠灌胃冠心丹参片的悬浊液150 mg／kg，第4组为灌胃等容积生理盐水并注射冠心丹参注射100 mg /kg，每日灌胃，连续给药两周，末次给药后40 min，将小鼠用1.5％戊巴比妥钠30 mg／kg腹腔注射麻醉，仰位固定于小鼠解剖台上，四肢插入心电图针形电极，置心电监护仪下，观察标Ⅱ导联心电图。手术剪开小鼠颈部，分离气管，观察从夹闭小鼠气管至小鼠心电图消失时间，所得数据用组间t检验，比较给药组与生理盐水对照组之间的差异。

2.2.5 冠心丹参注射剂对小鼠常压耐缺氧的影响

取小鼠32只，雌雄各半，体重18～22 g，平均体重（19.6±1.2 ）g，随机分为4组，每组8只，第一组灌胃等容积生理盐水，第2组灌胃冠心丹参片的悬浊液150 mg／kg，第3组灌胃冠心丹参片的悬浊液100 mg／kg。第4组灌胃生理盐水，注射冠心丹参注射剂100 mg／kg，连续灌胃14 d，末次给药后40 min，将小鼠置于内装200 mL广口瓶内，瓶口涂抹凡士林，盖紧瓶盖，记录小鼠装入瓶内盖紧瓶盖至小鼠停止呼吸的时间，即为小鼠常压耐缺氧时间，数据用组间t检验。

2.2.6 对小鼠出血时间的影响

取小鼠32只，雌雄各半，体重18～22 g，平均体重（19.6±1.2） g，随机分为4组，每组8只，第一组灌胃等容积生理盐水，第2组灌胃冠心丹参片的悬浊液150 mg／kg，第3组灌胃冠心丹参片的悬浊液100 mg／kg。第4组灌胃生理盐水，注射冠心丹参注射剂100 mg／kg，连续给药7 d，末次给药12 h，用毛细管法测定出血时间。

2.2.7 统计方法 采用单因与方差分析及q检验。

3 实验结果

3.1 见表1。

表1 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后左心室收缩压(LVSP)的影响注：与溶剂对照组比较， P<0.05

3.2 见表2。

表2 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后左心室舒张压(LVDP)的影响 注：与溶剂对照组比较， P<0.05

3.3 见表3。

表3 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后左心室等容期压力最大变化速率组别 注：与溶剂对照组比较， P<0.05

3.4 见表4。

表4 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后左心室等容期压力最大变化速率 注：与溶剂对照组比较， P<0.05

3.5 见表5。

表5 冠心丹参注射液对大鼠缺血再灌注后

乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性的影响 注：与溶剂对照组比较， P<0.05

3.6 电镜观察结果 假手术组心肌细胞膜完整，线粒体膜完整，嵴致密，基质颗粒均匀(图l A)。溶剂对照组细胞水肿，部分心肌细胞膜局部破裂；线粒体分布紊乱、肿胀，外膜破损，嵴减少、排列紊乱、模糊不清、甚至断裂消失，基质减少，线粒体内大片空化(图1 B)。冠心丹参片 组心肌线粒体改变明显轻于溶剂对照组，心肌细胞膜无破裂，肌原纤维完整有序；线粒膜完整，嵴致密，基质密度变淡，局部出现空化区域(图1 C)。冠心丹参注射剂 组心肌细胞膜无破裂，肌原纤维完整有序；线粒体体膜完整，嵴致密，基质颗粒均匀(图1 D)，放大20 000倍。A.假手术组;B.溶剂对照组;C.冠心丹参片对照组;D.冠心丹参注射液对照组

图1 电镜观察结果×20 0003.7 见表6。

表6 冠心丹参注射液对小鼠出血时间的影响 （n=8，±s）组别时间/s假手术组437±90.5冠心丹参片预处理组100 mg／kg533±78.2冠心丹参片预处理组150 mg／kg538±89.7冠心丹参注射剂预处理组100 mg／kg584±99.2注：与溶剂对照组比较， P<0.05

3.8 见表7。

表7 冠心丹参注射液对夹闭小鼠气管 心电消失时间的影响 注：与溶剂对照组比较， P<0.05

3.9 见表8。

表8 冠心丹参注射液对小鼠耐缺氧 时间的影响 注：与溶剂对照组比较， P<0.05

4 讨论

本实验通过麻醉开胸后冠脉结扎造成SD大鼠缺血再灌注心肌损伤模型，从血流动力学、生物化学和病理组织学上综合评价冠心丹参注射液对大鼠心肌的保护用。结果表明，冠心丹参注射液100 mg·kg-1预处理组可明显改善大鼠心肌缺血再灌注引起的心舒缩功能和血清心肌酶学的改变，并且从超微结构上减少缺血再灌注引起的心肌细胞线粒体损伤。冠心丹参注射液主要药理作用为扩张冠脉、增加冠脉流量，改善微循环，抑制血小板聚集，抗心律失常和抗血栓形成等［1］。本实验证实大鼠冠心丹参注射液灌胃抗心肌缺血再灌注损伤作用，提示冠心丹参注射液不仅可用于治疗和预防心绞痛，对于预防和治疗心肌缺血再灌注损伤也有积极的治疗价值。目前认为，心肌缺血再灌注过程中，再灌注对心肌的损伤比缺血期更为严重，这种损伤主要与心肌细胞内Ca2+ 超载有关［2］ 。有研究表明，丹参阻止Ca2+ 内流，减轻Ca2+ 超载，减少ATP的分解，能够减少缺血心室肌细胞APD不均一性以及缓解此时出现的Ca2+ 超载现象，因而可能减少因折返或自律性增高所导致的心律失常的发生。丹参具有ATP敏感钾通道的开放作用，但丹参是否具有开放线粒体或肌浆膜的ATP敏感钾通道作用尚待证实。