补肾健脾方体外抗乙型肝炎病毒作用的血清药理学分析

【摘要】 ：【目的】采用血清药理学方法探讨补肾健脾方体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。【方法】补肾健脾方低、中、高剂量（分别为30.2、60.4、120.8g·kg-1)灌胃正常大鼠制备血清，将含药血清直接添加于体外培养的2.2.15细胞中，培养10d，观察含药血清对2.2.15细胞HBV表面抗原（HBsAg）、HBV e抗原（HBeAg）分泌的影响。 【结果】补肾健脾方经体内代谢后能抑制2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的分泌，并呈一定的量效与时效关系。低剂量组服药后3h 1：4稀释度含药血清的HBeAg抑制率最高，为97.91%；而中剂量组服药后3h 1：2稀释度的含药血清则达到抑制HBsAg的饱和量，其抑制率为86.84%。【结论】补肾健脾方具有一定的体外抗HBV作用。

【关键词】 补肾健脾方/药理学 肝炎病毒 乙型/药物作用 细胞培养 血清药理学

乙型肝炎病毒（HBV）感染至今仍无较理想、稳定的治疗药物，拉米夫定等核酸抑制剂虽被认为是目前治疗HBV感染最有希望的药物［1］，但停药后易复发，并可引起HBV突变，产生耐药性，因而需要寻找更好的抗病毒药物。目前抗HBV药物的体外筛选主要通过药物直接作用于2.2.15细胞，观察其毒性及对HBV表面抗原（HBsAg）、HBVe抗原（HBeAg）分泌的影响来判断［2-3］。但药物直接作用有效并不等于口服吸收经体内代谢后仍有效，因此，本实验采用血清药理学方法来探讨中药复方的体外抗HBV作用，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 药物

补肾健脾方(药材均取自广州中医药大学第一附属医院药剂科)组成：猪苓20g，茯苓20g，白术15g，泽泻20g，黄芪30g，桑寄生30g，仙灵脾12g，葛根30g，苦味叶下珠30g，白花蛇舌草30g，白背叶根30g，山楂15g，丹参20g。按原方的剂量(总药量为302g)常规煎煮，并浓缩成3.02g/mL的浓度。

1.2 试剂

DMEM(GIBCO)培养基（华美生物工程公司），另加入新霉素 (G418，由GIBCO提供)0.38g/L， HEPES(缓冲液)2.38g/L；四甲基偶氮唑盐 (MTT，由SIGMA公司提供)以DMEM培养基作溶剂配成0.4g/L；二甲基亚砜(广州新港化工厂)； HBeAg检测试剂盒、HBsAg检测试剂盒（ELISA法，由华美生物工程公司提供）。

1.3 细胞株

2.2.15细胞引自广州空军医院。

1.4 实验动物

SD大鼠20只，体质量约为250g ，雌雄各半。由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.5 主要仪器

二氧化碳孵箱(NAPCO 5410)；酶标仪(BIORAD:3550)；TILD台式冷冻离心机。

1.6 实验方法

1.6.1 细胞培养 将长满2.2.15细胞的培养瓶用0.6g/L的胰蛋白酶消化2～3min，弃消化液，加少量100g/L DMEM培养液轻轻吹打，将细胞配制成3×108/L单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，其中留2孔作空白对照，其他每孔加细胞悬液0.1mL，空白孔每孔加100g/L DMEM 0.1mL， 37℃、体积分数5%CO2培养48h，贴壁后用于实验。

1.6.2 药物血清的制备［4-6］ 20只SD大鼠 随机分成4组，分别为中药低、中、高剂量组和正常血清组。正常血清组用2只大鼠，中药低、中、高剂量组各用6只大鼠，分别按30.2、60.4、120.8g·kg-1剂量灌胃（相当于50kg成人所用剂量的5、10、20倍），每日分2次灌胃，连续3d，末次给药后1、2、3h（每个剂量的每个时间段各用2只大鼠），于无菌条件下自腹主动脉采血；正常血清组大鼠灌以蒸馏水，并于最后同时采血；静置后，低温离心（10000r/min，5min）分离血清，保存于-20℃备用。

1.6.3 含药血清对细胞的毒性试验和抑制试验 将10种不同条件的20份血清（含正常血清2份）分别按1：0、1：1的比例与20g/L DMEM维持液混和，各取100 μL/孔加入1个已滴有2.2.15细胞的96孔细胞板中，即血清终浓度为1：2和1：4，每种血清每个稀释度取2孔，并设细胞对照组(不加药)4孔及空白对照组2孔。细胞对照组及空白对照组每孔均加入20g/L DMEM 100μL。

加入血清后培养10d，吸取培养液放入另一个96孔板中，采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行HBsAg和HBeAg测定，用酶标仪以450nm波长测定D值，求出含药血清对抗原的抑制百分率［2］：p抑制/%=（D细胞对照组-D给药组）/（D细胞对照组-D空白对照组）×100%。

药物对抗原的抑制百分率：p抑制/%=（D正常血清组-D含药血清组）/（D正常血清组-D空白对照组）×100%。

原96孔板中每孔加0.4g/LMTT0.1mL， 37℃、体积分数5%CO2孵育4h，弃上清后加二甲基亚砜0.1mL溶解，然后以490nm波长比色测定D值，求出含药血清对细胞的破坏百分率［4］：p抑制/%=（D细胞对照组-D给药组）/（D细胞对照组-D空白对照组）×100%

1.7 统计方法 组间均数比较采用独立样本t检验（SPSS 8.0 for windows 统计软件包）。

2 结果

2.1 含药血清对2.2.15细胞的毒性作用

MTT的D值能间接反映细胞存活情况，D值越高，细胞存活数目越多，反之亦然。从表1可看出，各组血清对2.2.15细胞无毒性作用，反而能促进其生长，且与一定的血清浓度成正比，与药物的有无关系不大，这可能与血清中含有丰富的营养成分等物质能促进体外细胞生长有关。

2.2 含药血清对2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的影响

2.2.1 正常血清组与细胞对照组比较

从表1可知，正常血清组HBsAg、HBeAg D值与细胞对照组比较均有显著性差异（P＜0.01）。但正常血清组的2个浓度之间均无显著性差异（P＞0.05），表明正常大鼠血清中可能含有抑制两抗原分泌的物质，至于具体是什么物质，将有待进一步研究。

2.2.2 中药各剂量组与细胞对照组比较

表1结果显示，中药各剂量组的HBsAg、HBeAg D值与细胞对照组比较有显著性差异（P＜0.01），表明含药血清能抑制两抗原的分泌。

2.2.3 中药低、中、高剂量终浓度为1：2的含药血清与同浓度正常血清组比较表1 含药血清各剂量组的细胞毒性及对两抗原的抑制作用

2.2.4 中药低、中、高剂量终浓度为1：2、1：4的含药血清组比较

表1结果显示，除中药低剂量组两浓度对HBeAg的抑制无显著差异外，其他各剂量组均以1：2浓度对两抗原的抑制作用较强。

2.2.5 中药低、中、高剂量终浓度为1：2的含药血清组比较

表1、表2结果显示，中药低、中、高剂量1：2含药血清组间的HBeAg D值均无显著性差异，其对HBeAg的抑制率分别为94.68%、95.01%、93.77%。HBsAg D值中药中、高剂量组较低剂量组显著性降低。

以上结果表明，中药低剂量终浓度为1：4时已达到最大限度抑制HBeAg的饱和量，而要达到近乎最好的HBsAg抑制效应则须中剂量终浓度为1：2的含药血清，在这以前，抑制率随剂量的增加而增高，达到最高抑制效应（饱和量）以后，再加大药量亦不能使其抑制率显著增高。

2.2.6 中药各剂量灌药后1、2 、3h终浓度为1：4含药血清对HBeAg抑制作用的比较

从表3可看出，对于HBeAg的抑制作用，中药低剂量1h与2h无显著性差异（P＞0.05），而2h与3h则有显著性差异（P＜0.01），说明灌药后3h的抑制作用最强。

2.2.7 中药各剂量组1、2、3h终浓度为1：2含药血清对HBsAg抑制作用的比较

由表4可看出，对于HBsAg的抑制作用，中药中剂量1h与2h、2h与3h均无显著性差异（P＞0.05），而1h与3h则有显著性差异（P＜0.05），以3h的抑制率最高。

以上含药血清对两抗原的抑制率均是药物和血清共同作用所得的结果。但由于正常血清对两抗原亦有一定的抑制作用，因此若要排除正常血清作用的干扰，单纯考虑药物经体内代谢后对两抗原的抑制率，如表5所示：药物经体内代谢后对2.2.15细胞HBeAg、HBsAg的最高抑制率分别为94.53%和65.75%。 3 讨论

现代医学对慢性乙型肝炎的病原体、流行病学、自然病程、发病机制、病理变化等方面均作了较深入的研究，但至今仍未能找到彻底治疗HBV感染的药物。目前国内有关中医药治疗慢性乙型肝炎的研究不少，在其病因病机的认识方面也基本一致，主要是"湿热余邪兼血瘀，肝郁脾肾气血虚"。我院消化内科罗日永教授在继承已故肝病名医钟耀奎教授学术思想的基础上，结合自己多年的临床经验，提出慢性乙型肝炎的治疗关键在于补脾肾、清余邪，采用健脾补肾为主，佐以清热利湿的治法，其自拟的补肾健脾方在临床治疗慢性乙肝患者取得了较好的疗效［7］。

根据现代药理学研究发现［8］，苦味叶下珠、山楂有较强的抗HBV作用，泽泻有明显的退黄作用，丹参是目前公认的抗纤维化的良好药物，而黄表2 不同剂量含药血清对HBsAg、HBeAg的抑制率表3 中药各剂量组1、2、3h终浓度为1：4含药 ①：P＜0.01，与中药低剂量2 h组比较(vs 2hour lowdose KSP group)芪、白术、茯苓、猪苓、白花蛇舌草、仙灵脾、葛根均有较强的免疫调节作用，如黄芪、猪苓、茯苓能提高巨噬细胞系统吞噬能力及自然杀伤细胞（NK细胞）、淋巴因子激活杀伤细胞（LAK细胞）的活性，使CD3、CD4明显增高、CD4/CD8比值升高，调节细胞因子，促进产生白细胞介素2（IL2）和IL2受体（IL2R），促进细胞免疫反应及溶解免疫复合物、抗肿瘤作用；白术除能促进免疫功能外，还可增强肾上腺皮质功能及护肝抗肿瘤作用；葛根还可诱导肿瘤坏死因子（TNF）的产生、抑制超敏反应、增强机体抗感染力；白花蛇舌草还有抗肿瘤、抗炎作用 。

补肾健脾方各组成药物的免疫调节作用基本得到初步的证实，但究竟有无直接抗病毒的作用则未见报道。目前评价药物体外抗HBV作用常用的2.2.15细胞系是用含有2个头尾相连HBVDNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成的［3］，表4 中药各剂量组1、2、3h终浓度为1：2含药表5 药物经体内代谢后对2.2.15细胞两抗原的能持续高量地分泌HBsAg和HBeAg。而通过药物对HBsAg、HBeAg分泌的影响，可作为评价药物体外抗HBV作用的一个指标［2］。由于中药复方成分复杂，杂质也较多，如果把药物直接作用于细胞，往往不能真实反映药物的临床有效作用。因此，本实验尝试采用血清药理学的方法，希望能更真实地反映药物通过体内代谢后对细胞的毒性和对两抗原的作用。本研究结果表明了补肾健脾方药物经体内代谢后能有效地抑制2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌，而无明显毒性，较药物直接作用于无毒浓度下的抑制率高［9］，且能更真实地反映药物的真正抗HBV作用，为体外抗HBV实验在方法学上的改进提供了依据。从实验结果中我们发现，HBeAg对药物敏感性较好，只需较低剂量即可被有效抑制，而HBsAg则需较高剂量才能被有效抑制。

同时，本实验还发现正常大鼠血清在促进2.2.15细胞生长的同时，能有效地抑制HBsAg和HBeAg的分泌，这到底是由于血清中干扰素等细胞因子的作用所致，还是其他原因所致，尚待进一步研究。

【参考文献】

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［7］罗日永，何钜楠.健脾补肾法治疗乙肝e抗原阳性95例临床观察［J］.广州中医药大学学报，1996，13（3、4）:21.

［8］骆和生，罗鼎辉，王培训，等.免疫中药学:中药药理与临床［M］.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1994:4.

［9］何婉婉，刘妮，肖会泉.补肾健脾方体外抗乙型肝炎病毒作用的初步研究［J］. 广州中医药大学学报，2002，19（1）：30.