骨炎定促进血管内皮细胞增殖的血清药理学分析

作者：曹燕明 徐海波 张薇 陈基长

【关键词】 骨性关节炎/中药疗法;，骨炎定/药物作用;，细胞培养;，兔

摘要: 【目的】观察补肾益气活血方骨炎定对血管内皮细胞增殖的影响。【方法】将新西兰兔随机分为空白组和骨炎定低、中、高剂量组（剂量分别为2.5、5、10g/kg）;以骨炎定高剂量灌胃给药，连续7d，于最后1次给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h分别取血，分离含药血清，作用于人脐静脉内皮细胞，以四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同时相的骨炎定含药血清对血管内皮细胞的增殖作用;并取给药后2h含药血清，部分灭活，比较灭活血清与不灭活血清对血管内皮细胞增殖的影响，以及检测不灭活含药血清不同作用时间（12、24、36h）对内皮细胞增殖的影响;以骨炎定低、中、高剂量灌胃给药，连续7d，取最后1次给药后2h含药血清，观察不同剂量骨炎定对血管内皮细胞增殖的影响。【结果】高剂量骨炎定给药后0.5～4h制备的含药血清对血管内皮细胞增殖均有显著促进作用（均P<0.01），其中以给药后2h者作用最强;灭活与不灭活血清均对血管内皮细胞增殖具有促进作用（P<0.01），且后者作用强于前者（P<0.05）;不灭活含药血清作用12、24、36h后均对血管内皮细胞增殖具有促进作用（P<0.01），且呈时效关系;低、中、高剂量骨炎定含药血清均对血管内皮细胞具有促进作用（P<0.01），并呈量效关系。【结论】补肾益气活血方骨炎定对血管内皮细胞增殖具有促进作用。

关键词: 骨性关节炎/中药疗法; 骨炎定/药物作用; 细胞培养; 兔

在骨性关节炎（OA）的病理机制中，骨组织血管萎缩、数量减少、血供不足是非常重要的一环，而血管在骨的形成和修复过程中所起的重要作用在于丰富的血管是保障骨组织再生时血供充分的必要条件 ［1］ 。补肾益气活血方骨炎定（Guyan ding）是陈基长教授根据中医理论，并结合自己多年的临床经验总结出的经验方，主治骨性关节炎。经多年临床研究证实，该方可改善OA患者的关节疼痛、肿胀和功能障碍，改善骨内压和异常的血液循环，在临床中取得显著疗效 ［2］ 。本文观察了骨炎定含药血清对促进血管内皮细胞增殖的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物 骨炎定由红花、牛膝、补骨脂、骨碎补、黄芪组成，按常规方法煎煮，经纱布过滤并浓缩成含生药2kg/L的药液，置4℃冰箱保存备用。 1.2 动物 新西兰兔，雌雄各半，体质量（2.0±0.2）kg，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为2000A018。

1.3 实验方法

1.3.1 不同时相的含药血清促进血管内皮细胞增殖的作用 ［3-4］ 新西兰兔4只，随机分成空白组和骨炎定组，雌雄各半。骨炎定组以10g/kg剂量灌胃给药，空白组以等容积的蒸馏水灌胃，每天2次，早晚各1次（每日药物总量相当于60kg成人临床用量的20倍），连续7d。于最后1次灌胃（灌胃前禁食不禁水12h）后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h兔耳中央动脉采血，无菌分离血清，经0.45μm、0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌，置-40℃低温冰箱保存备用。将购自CCTCC（中国典型培养物保藏中心）的人脐静脉内皮细胞培养至第3～5代，以含体积分数为15%小牛血清的DMEM培养液调成5×10 7 个/L的细胞悬液，100μL/孔接种于96孔培养板中，于37℃、体积分数为5%CO 2 温箱中饱湿静置培养48h;更换无血清的DMEM培养液，使细胞同步化12h，每孔加入100μL不同时相采集的空白兔血清或骨炎定含药血清，每组均设8个平行孔，总体积为200μL/孔;置37℃、体积分数为5%CO 2 温箱中饱湿静置培养36h，每孔加入5g/L的四甲基偶氮唑盐（MTT）溶液20μL，继续培养4h以进行显色反应;以体积分数为50%二甲基甲酰胺（DMF）―200g/L十二烷基硫酸钠（SDS）0.1mL终止反应，室温静置过夜;待孔内蓝色结晶完全溶解后置酶标仪上测波长570nm处吸光度（D）。

1.3.2 血清灭活与否对血管内皮细胞增殖的影响 ［4-5］ 按1.3.1方法选取最后1次灌胃给药后2h的兔进行耳中央动脉采血，无菌分离血清，一部分血清经56℃、30min灭活处理;一部分不灭活，经0.45μm、0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌，置-40℃低温冰箱保存备用。采用1.3.1方法检测灭活血清和不灭活血清对血管内皮细胞增殖的影响。

1.3.3 不同剂量的含药血清促进血管内皮细胞增殖的作用 ［3，5］新西兰兔8只，随机分成空白组和骨炎定低、中、高剂量组，雌雄各半。骨炎定低、中、高剂量组分别以2.5、5、10g/kg灌胃给药，空白组灌胃等容积的蒸馏水，每天2次，早晚各1次（每日药物总量分别相当于60kg成人临床用量的5倍、10倍、20倍），连续7d。于最后1次灌胃后2h兔耳中央动脉采血，无菌分离血清，经0.45μm、0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌，置-40℃低温冰箱保存备用。采用1.3.1方法检测不同剂量的含药血清对血管内皮细胞增殖的作用。

1.3.4 不同作用时间的含药血清促进血管内皮细胞增殖作用的比较采用1.3.1方法检测骨炎定含药血清（10g/kg）作用于血管内皮细胞12、24、36h后的反应。

1.4 统计学处理

数据的统计处理采用SPSS10.0统计软件包，数据先进行方差齐性检验，随后进行方差分析，最后采用Dunnett法进行组间比较。

2 结果

2.1 不同时相的含药血清促进血管内皮细胞增殖的作用 表1结果表明，给新西兰兔每天灌胃2次，早晚各1次，连续7d，于最后1次给药后2h制备的含药血清对血管内皮细胞增殖的促进作用最强，与空白组比较，差异具有非常显著性意义（P<0.01），即给药后2h血药浓度达到高峰。经每天在固定时间间隔给药2次、连续7d的方法可使血药浓度保持在较高水平内波动，药后0.5h至4h制备的含药血清对血管内皮细胞增殖具有较强的促进 作用（均P<0.01）。为了更准确地研究含药血清对血管内皮细胞增殖的促进作用，在以下的实验中均采用药后2h采血的方法制备含药血清。 2.2 血清灭活与否对血管内皮细胞增殖的影响表2结果表明，灭活与未灭活空白兔血清对血管内皮细胞增殖的影响无显著性差异（P>0.05）。灭活高剂量含药血清与未灭活高剂量含药血清对血管内皮细胞增殖都有显著的促进作用（P<0.01），且后者作用强于前者（P<0.05）。为了更准确地研究含药血清对血管内皮细胞增殖的促进作用，在以下的实验中均采用未灭活血清。

2.3 不同剂量的含药血清促进血管内皮细胞增殖的作用表3结果表明，骨炎定低、中、高剂量含药血清对血管内皮细胞增殖均有促进作用（P<0.01），且呈现明显剂量效应关系。

2.4 骨炎定含药血清不同作用时间促进血管内皮细胞增殖作用的比较表4结果表明，未灭活空白兔血清能维持血管内皮细胞生长（P<0.05），未灭活高剂量含药血清在作用12、24、36h后对血管内皮细胞增殖均有显著的促进作用，且随着作用时间的延长，其促进作用增强（P<0.01），呈现时间效应关系。

3 讨论

骨性关节炎属于祖国医学“骨痹”范畴，其病因病机主要为久伤劳挫，瘀血阻络，肝肾亏损，筋骨虚弱，治疗以补肝肾，强筋骨，益气行血为原则。有研究表明各种致病因子所造成的全身或局部组织器官的缺血、缺氧、血循环障碍、血液流变性及粘滞性异常而导致的各组织器官水肿、炎症渗出、血栓形成、组织变性、结缔组织增生等一系列病理变化，均可概括在血瘀证的病理实质之中，而这些病变的中心环节在于血管内皮细胞的变化 ［6］ 。活血化瘀法可降低骨内压 ［7］ ，改善骨性关节炎的症状 ［8］ 。且既往的研究及观察发现在胚胎时骨形成与血管生成密切相关 ［9］ 。所谓骨生发中心即位于血管化的环境中，而成骨细胞和骨祖细胞在新骨形成过程中总伴有毗邻血管内皮细胞存在。无论膜内成骨、软骨内成骨或骨折愈合均与血管存在与否有着密切的关系。与此同时，还发现当老年试验对象或患者发生骨质疏松时，总是成骨细胞与血管生成同时减少。芮钢等 ［10］ 将血管内皮细胞与成骨细胞联合培养，发现成骨细胞与血管内皮细胞具有良好的 表1 高剂量骨炎定含药血清对血管内皮细胞增殖影响的变化趋势细胞相容性，血管内皮细胞能够增强成骨细胞的功能，提高成骨细胞的增殖能力。血管内皮细胞增生可加速骨组织的再血管化过程，从而为成骨细胞提供正常的营养、神经和体液调控。骨炎定是复方制剂，有的成分对软骨细胞有保护作用 ［11］ ，有的成分对骨性关节炎的骨坏死有修复作用，本研究结果显示骨炎定可促进血管内皮细胞的增殖，这是否与该方可修复被破坏的软骨细胞和骨细胞，缓解骨性关节炎中晚期症状的机理有关，有待进一步研究。

本实验研究还表明，每天在固定时间间隔给药2次、连续7d的方法可使血药浓度维持在较高水平内波动，药后0.5h至4h制备的含药血清均对血管内皮细胞增殖有较强的促进作用 ［4］ 。灭活与未灭活空白兔血清对血管内皮细胞增殖的影响无显著 性差异。但未灭活高剂量含药血清对血管内皮细胞增殖的促进作用比灭活的高剂量含药血清更强。是否药物作用于机体后产生了能促进血管内皮细胞增殖的类血管内皮细胞生长因子样的内源性生理活性物质，而这种内生性有效成分又不耐热，其原因有待进一步证实。

未灭活低、中、高剂量含药血清对血管内皮细胞增殖均有促进作用，且呈现剂量效应关系。未灭活高剂量含药血清在作用12、24、36h后对血管内皮细胞增殖均有促进作用，且随着作用时间的延长，其促进血管内皮细胞增殖的作用增强。但临床上究竟采用多大的剂量、多长的疗程疗效最好，且不良反应最少，也尚需进一步观察研究。

［1］ Guenther H L，Fleisch H，Sorgente N.Endothelial cells in culture synthesize a potent bone cell active mitogen ［J］.Endocrinology，1986，119:193.

［2］唐勇，姜红，周永红，等.骨炎定治疗膝骨性关节炎30例―――附醋氨酚治疗30例对照［J］.浙江中医杂志，2003，38（10）:430.

［3］吴清和，荣向路，黄萍，等.三黄乙肝胶囊对HBeAg抑制作用的血清药理学研究［J］.中药材，2000，23（5）:275.

［4］刘成海，刘平，刘成，等.抗肝纤维化有效中药复方血清药理 学方法探讨［J］.中国实验方剂学杂志，1998，4（2）:16.

［5］徐海波，吴清和.中药血清药理学实验方法的探讨［J］.中国中医药科技，2000，7（1）:43.

［6］刘杰文，齐淑玲.血瘀证实质和活血化瘀药物作用机理的研究［J］.中医药通报，2003，2（1）:2.

［7］郑召民，许振华.骨内压与活血化瘀［J］.中国中医骨伤科， 1994，2（3）:43.

［8］王海斌，赵咏芳，石印玉.骨关节炎和骨内压［J］.中国中医骨伤科杂志，1997，5（3）:49.

［9］陈希哲，杨连甲.血管内皮生长因子与骨的形成和修复［J］.中华骨科杂志，2001，21（7）:440.

［10］芮钢，王者生，吕钢.成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性［J］.中国修复重建外科杂志，2004，18（4）:327.

［11］郑晓辉，周琦石，王海彬，等.骨炎定含药血清对人骨关节炎软骨细胞保护作用的机理探讨［J］.广州中医药大学学报，2005，22（3）:213.