莪芪抗瘤方剂诱导白血病HL-60细胞凋亡的血清药理学分析

【摘要】 目的 研究中药复方莪芪抗瘤方剂在体外对白血病HL-60细胞凋亡的作用，并探讨凋亡发生与细胞内Ca2+、Caspase-3、Bcl-2的关系。方法 通过血清药理学方法，选择10%浓度的含药血清与白血病HL-60细胞共同培育24、48、72、96 h后，应用荧光显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测凋亡峰(亚二倍体峰)，用Fura-2荧光负载方法测定细胞内Ca2+浓度的变化。比色法检测凋亡相关基因Caspase-3活性变化。亲和免疫组化LSAB 法检测HL-60细胞Bcl-2基因表达。结果 10%浓度的含药血清处理组细胞体积缩小，细胞核固缩，膜起泡，核断裂及形成凋亡小体等，以72 h最为明显；可见DNA含量低于G1期的凋亡细胞群，这群细胞的凋亡百分率随时间的递增而增加。10%浓度的含药血清处理组的细胞内Ca2+浓度也明显高于对照组(P<0.01)，Caspase-3浓度明显高于对照组(P<0.01)，Bcl-2基因表达明显低于对照组(P<0.05)。结论 莪芪抗瘤方剂含药血清诱导白血病HL-60细胞发生凋亡，这种变化可能与细胞内Ca2+、Caspase-3水平上调及Bcl-2表达下调有关。

【关键词】 莪芪抗瘤方剂；白血病；Caspase-3；Bcl-2

Abstract：Objective To explore the apoptotic effect of Eqi compound prescription (contained-herb serum) on cute myelocytic leukemia HL-60 cell， which is relative to intracellular Ca2+， Caspase-3 and Bcl-2. Methods According to serum pharmacology， HL-60 cells were exposed to 10% concentrations of contained-herb serum for 24， 48， 72 and 96 hours respectively. Cells were observed under a fluore- scence microscope. SubG1 DNA was examined by flow cytometer. Intracellular Ca2+ concentration was measured by fura-2 fluorescence load method. Caspase-3 enzymatic activity were measured by colorimetry. Bcl-2 gene expression were measured by LSAB. Results The contained-herb serum could induce apoptosis of HL-60 cells. Intracellular Ca2+ concentration of treatment with Eqi was higher evidently than that of control (P<0.01). Caspase-3 gene expression of treatment with Eqi was higher evidently than that of control (P<0.01). Bcl-2 gene expression of treatment with Eqi was lower evidently than that of control (P<0.05). Conclusion According to serum pharmacology， Eqi compound prescription could induced apoptosis of acute myelocytic leukemia HL-60 cell， which is relative to up-regulating Ca2+， Caspase-3 and down-regulating Bcl-2.

Key words：Eqi compound prescription；acute myelocytic leukemia；apoptosis；Caspase-3；Bcl-2 越来越多的研究表明，细胞内Ca2+水平升高与诱发细胞凋亡密切相关[1]。细胞内凋亡相关基因Caspase-3活性变化对凋亡的诱导起重要促进作用[2]。Bcl-2 是重要的抑凋亡基因之一，过度表达Bcl-2的急性白血病细胞抑制凋亡[3]。本实验主要观察莪芪抗瘤方剂(含药血清)对白血病HL-60细胞内Ca2+浓度、促凋亡基因Caspase-3活性及抑凋亡基因Bcl-2表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

日本大耳白兔，雄性，体重2.5～3 kg，兰州医学院实验动物室提供。

1.2 药物

莪芪抗瘤方剂由莪术、三棱、黄芪、女贞子等药物组成，甘肃省药材公司饮片厂提供，按工艺制成每1 mL含原药材5 g的浸膏，4 ℃保存备用。

1.3 含药血清的制备

以纯种雄性日本大耳白兔10只，每日给予含莪芪抗瘤方剂浸膏10 g/kg灌胃，另设3只为对照组(生理盐水组)。连续10 d，于最后一次灌药后1 h(灌药前禁食、不禁水12 h)，心脏采血并分离血清，经56 ℃、30 min灭活，无菌过滤后，置-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 细胞培养

HL-60细胞由兰州医学院血液病研究所传代保存，采用常规培养。培养液为含10%的小牛血清，青、链霉素各100 U/mL的RPMI-1640，在37 ℃、饱和湿度、5% CO2孵箱中培养，每2～3 d换液传代培养。

1.5 细胞形态学观察

参照文献[4]方法略加改动，将细胞以1×104接种于96空板中，24 h细胞贴壁后，弃上清。加入10%的含药血清培养基处理细胞，另设未加药对照组。每12 h收集对照及药物处理组细胞，离心涂片，用无水乙醇固定10 min后，加1.2 μg/mL吖啶橙染色30 min，于荧光显微镜下观察细胞染色质及RNA变化并拍照。

1.6 流式细胞术分析

参照文献[5]略加改动，离心收集1×105个细胞，将细胞悬于200 μL冷PBS中，冰冻的体积分数为70%的乙醇2 mL于4 ℃固定24 h，离心收集细胞，重悬于500 μL PBS，另加入RNA酶(100 mg/mL)， 0.1%Triton X-100缓冲液，37 ℃孵育30 min， 4 ℃，50 mg/mL碘化丙锭染色30 min，流式细胞仪(EPICS XL；Coulter，USA)检测DNA含量。

1.7 细胞内Ca2+浓度测定 参照文献[6]方法进行。用100 mL 培养瓶，接种5×105个细胞/瓶，药物处理24 h后，每12 h收集对照及药物处理组细胞，用胰蛋白酶消化，两瓶细胞收集成一组，每组调整细胞浓度1.5×106个细胞/mL，用含0.2牛血清白蛋白(BSA)的RPMI-1640培养液3 mL制成细胞悬液。设定发射波长500 nm，光栅10 nm，在37 ℃下用激发波长为340 nm和380 nm测定自发荧光；加Fura-2/AM(终浓度为1.67 μg/mL)5 μL，37 ℃恒温振荡45 min；加Fura-2/AM扩散入细胞膜后其脂溶性基团AM被酯解，释放出Fura-2， Fura-2最大激发波长为380 nm，而与细胞内游离Ca2+结合后最大激发波长移至340 nm，离心，去上清，用HBSS-BSA缓冲液洗涤2次，加3 mL HBSS-BSA缓冲液制成细胞悬液，用上述2个激发波长测定负载Fura-2的荧光强度；然后加Triton X-100 15 μL裂解细胞，测这2个激发波长的最大荧光强度，最后加0.1 mol/L EGTA(pH 8.7)500 μL络合Ca2+测这2个激发波长的最小荧光强度。根据文献[6]制定的公式计算细胞内Ca2+浓度。

1.8 Caspase-3活性检测

分别收集诱导组、未诱导组2×106个细胞，1000 r/min×5 min，弃上清。将细胞重新悬浮于50 μL冷细胞裂解缓冲液中，冰上放置10 min。4 ℃下12 000 r/min离心10 min，以去除细胞碎片。将上清转移至另一微离心管中，置于冰上。每组加入50 μL的2×反应缓冲液/DTT混合液。每管加入5 μL的1 mmol/L Caspase-3底物(DEVD-pNA，终浓度50 μmol/L)。水浴37 ℃孵育1 h。设立一个平行管不加底物，在405 nm波长下读取OD值。根据试剂盒说明所得斜率值(ΔOD/ΔnmolpNA)计算Caspase-3活性单位。

Caspase-3活性单位=(诱导组OD-未诱导组OD)/斜率

1.9 Bcl-2 基因表达测定 亲和免疫组化LSAB法检测10%的含药血清处理组和未加药对照组的HL-60细胞Bcl-2 基因表达，胞浆染为棕黄者为阳性细胞，油镜下随机计数300个细胞，计算阳性细胞数。

1.10 统计学方法

数据以x±s表示，用SPSS10.0软件进行组间t检验。

2 结果

2.1 荧光显微镜观察结果 莪芪抗瘤方剂(10%含药血清)经处理HL-60细胞24、48、72、96 h后，吖啶橙(AO)荧光观察可见，表现凋亡细胞的特征性形态变化：细胞体积缩小，细胞核固缩，膜起泡，核断裂及形成凋亡小体等，以72 h最为明显。

2.2 流式细胞仪分析HL-60细胞DNA含量 莪芪抗瘤方剂(10%含药血清)经不同时间处理后，可见DNA含量低于G1期的凋亡细胞群，这群细胞的凋亡百分率随时间的递增而增加。对照组凋亡率4.7%，莪芪抗瘤方剂(10%含药血清)分别处理HL-60细胞48、72 h后， 凋亡率分别为13.2%、23.1%。

2.3 细胞内Ca2+浓度测定

(见表1)表1 10% 含药血清作用于HL-60细胞不同时间细胞内Ca2+ 浓度检测结果(略)注：组间比较，P<0.01(下同)。

2.4 Caspase-3活性测定

(见表2)表2 10% 含药血清作用于HL-60细胞不同时间对Caspase-3 活性的影响(略)

2.5 Bcl-2 基因表达测定

(见表3)表3 10% 含药血清作用于HL-60细胞不同时间对Bcl-2表 达的影响(略)

3 讨论

20世纪80年代中期，Iwama H等[7]提出的“血清药理学”方法实现了体外与体内实验的结合，其实验结果与体内实验有较好的一致性。笔者采用该法对莪芪抗瘤方剂诱导HL-60细胞凋亡进行了实验研究。通过荧光染色、流式细胞仪分析测试发现，莪芪抗瘤方剂10%含药血清具有诱导白血病HL-60凋亡的作用，这种作用呈时间依赖性；细胞内游离Ca2+的动态变化在诱发凋亡机制的多个方面起重要作用；Ca2+作为第二信使参与磷脂酰肌醇系统、钙调蛋白系统或线粒体/细胞色素C介导途径的凋亡信号传递；作为金属辅助因子激活钙依赖性的核酸内切酶，使DNA降解或激活转录因子而参与凋亡的基因表达。在凋亡程序启动及执行过程中，称为凋亡效应器的Caspases蛋白酶家族起了非常重要的作用，直接参与凋亡早期启动，凋亡信号的传递以及凋亡晚期作用于不同凋亡底物，产生细胞皱缩、膜出泡、DNA 断裂等凋亡特征现象[8]。调亡的发生发展是受基因调控的，在参与调控的多种癌基因和原癌基因中，原癌基因Bcl-2是抑制细胞凋亡的主要基因之一，Bcl-2高表达可延长白血病细胞存活时间，抑制凋亡[9]。本研究结果显示，莪芪抗瘤方剂10%含药血清在诱导人类早幼粒白血病细胞株HL-60凋亡过程中，细胞内游离Ca2+水平明显升高、Caspase-3活性增加、Bcl-2表达下调；表明其含药血清诱导HL-60凋亡可能依赖于细胞内Ca2+、Caspase-3水平上调，Bcl-2表达下调。