用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱

作者：姜秀良，马加海，张惠，徐礼鲜，杨昌照，田明

【关键词】 基因芯片

【Abstract】 AIM: To investigate the alteration of gene expression profile of thalamus in rats anesthetized with propofol using gene chip. METHODS: Twelve SD rats were allocated randomly to 2 groups (6 in each group). 9 g/L saline， 100 mg/kg propofol were administered intraperitoneally in control group and propofol group respectively. One hour later， thalamus was dissected and the total RNA was isolated. cDNA was amplified through reverse transcript reaction. Biotinlabeled cRNA was synthesized using cDNA as template. After purification and fragmentation， the cDNA was hybridized with rat neurobiology U34 gene chips. Chips were scanned and genes were analyzed using Microarray Suite Version 5.0 software. Differentially expressed genes were classified according to their biological functions. RESULTS: Among the total 1323 probes detected， 221 genes showed differential expression in propofol group. The expression level of 80 and 141 genes increased or decreased respectively and 53 genes among them had expression level alteration over 2 times. The differentially expressed genes were mainly classified into ion channels， signal transduction， transcription factors and cytokines， etc. CONCLUSION: Propofol can induce a significant alteration of gene expression profile of thalamus in rats. Gene chip is an effective means of studying the underlying mechaninsm of general anesthetics.

【Keywords】 propofol; gene chip; gene expression profile; thalamus; rat

【摘要】 目的:运用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱的变化. 方法: SD大鼠12只，随机分为对照组和异丙酚组，每组6只. 对照组、异丙酚组大鼠分别腹腔注射生理盐水或100 mg/kg异丙酚. 1 h后，取丘脑，抽提RNA，以RNA为模板逆转录合成cDNA，以cDNA为模板转录生物素标记的cRNA，cRNA经提纯、片断化后与大鼠神经生物学表达芯片U34杂交；杂交后的芯片用扫描仪检测信号，收集图像，用Microarray Suite Version 5.0软件分析差异表达基因并对其作初步功能分析. 结果：1323条待测基因中，异丙酚麻醉后221条基因差异表达，上调表达80条，下调表达141条，其中差异表达超过两倍的为53条. 差异性表达的基因功能可分为离子通道、信号转导、转录因子、细胞因子等. 结论：异丙酚麻醉可诱导大鼠丘脑众多基因的差异表达，基因芯片是研究全麻机制的有效方法.

【关键词】 异丙酚；基因芯片；基因表达谱；丘脑；大鼠

0引言

全麻药作用于中枢神经系统(central nervous system， CNS)的确切机制目前仍不清楚［1］. 异丙酚主要是引起意识消失、体动反射消失和学习、记忆功能丧失等全麻效应. 近年来，又证实其具有镇痛、镇吐、脑保护及抗惊厥等作用. 基因芯片技术具有高通量、并行性和快速准确的优点，已应用于药物作用靶位和机制的研究［2］. 丘脑是中继外周伤害性信息的主要部位之一和全麻药作用的重要脑区［3-5］. 我们运用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱的变化，探讨异丙酚的CNS作用机制.

1材料和方法

1.1材料成年健康雌性SD大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)12只，体质量195～223 g，实验前将大鼠放置在安静、避强光的环境中饲养48 h以上. 随机分为对照组和异丙酚组，每组6只. 异丙酚组大鼠腹腔注射100 mg/kg异丙酚（Astra Zeneca），对照组注射同等体积的生理盐水.

1.2方法

1.2.1取材腹腔注射1 h后，大鼠断颈处死，取全脑组织，置于冰上，切取丘脑，切成0.3~0.5 cm小块，置于盛有RNAlater（Qiagen）的冻存管中，-20℃保存.

1.2.2RNA抽提、探针制备和芯片杂交简要步骤如下：用TRIzol Reagent（Invitrogen）试剂盒抽提丘脑组织总RNA；以RNA为模板，合成单链及双链cDNA；再以双链cDNA为模板，体外转录合成生物素标记的cRNA；cRNA用RNeasy（Qiagen）试剂盒纯化后，进行片段化处理，而后与测试芯片Test3（Affymetrix）预杂交进行质控；符合要求后分别与两张大鼠神经生物学表达芯片U34（Affymetrix）杂交；洗脱处理后染色，以G2500A GeneArray Scanner（Affymetrix）扫描检测信号，收集图像.

统计学处理:应用Microarray Suite Version 5.0软件（Affymetrix）分析某基因是否有表达，以及在异丙酚组和对照组表达程度是否有差异. 两组基因的差异性表达用两张芯片上对应探针之间的荧光信号强度比值的对数（Signal Log Ratio，SLR）表示，SLR表示异丙酚组较对照组某基因表达上调或下调倍数的以2为底的对数值. 根据基因编码蛋白的功能对差异表达超过两倍的基因进行了初步分析.表1异丙酚麻醉大鼠丘脑表达上调两倍以上基因（略）

2结果

2.1动物行为学对照组大鼠活动自如，异丙酚组大鼠注射异丙酚后，翻正反射消失，取材时仍未恢复.

2.2基因芯片异丙酚组和对照组分别有647条、692条基因表达，分别占芯片上探针总数（1323）的48.9%和52.3%. 与对照组相比，异丙酚麻醉后221条基因差异表达，其中上调表达80条，占总探针数的6.0%，超过两倍的为27条；表达下调的基因为141条，占总探针数的10.6%，超过两倍的为26条. 差异表达超过两倍（SLR≥2）的基因（表1，2）.表2异丙酚麻醉大鼠丘脑表达下调两倍以上基因（略）

2.3基因生物学信息分析除去5条功能未知基因，根据基因编码蛋白的功能对其它差异表达超过两倍的基因进行了初步分析，可分为离子通道基因、信号转导相关基因、转录相关基因、细胞因子基因、突触功能基因、细胞结构基因等.

3讨论

基因芯片是在固体基片表面上集成已知序列的基因探针(cDNA或寡核苷酸)，被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交，通过检测杂交探针的位置，实现基因信息的快速检测［6］. Chong等［7］用该技术研究注射氟哌利多28 d后大鼠纹状体的基因表达谱，发现待研究的1176条基因中，包括谷氨酸受体、钠通道、RasGTP酶等的14条基因的表达有显著性差异，认为基因芯片对研究药物中枢神经系统的神经转导通路具有重要意义. Affymetrix基因芯片是目前公认的最先进、最可靠的基因芯片平台. 我们采用的大鼠神经生物学表达芯片U34涵盖多种与神经生物学研究领域相关的基因序列，含有1323条探针组合（probe set）［8］. 丘脑作为感觉传入通路中重要的中继站，在感觉传入、痛觉调控及意识维持上有相当重要的作用，脑功能成像研究表明，丘脑是麻醉药发挥作用的主要靶位［3，5］.

目前认为全麻作用主要与配体门控型离子通道（如GABAA受体、NMDA受体），电压门控型离子通道（Ca2＋，K＋，Na＋），第二信使系统，中枢神经递质的摄取和释放有关，涉及非常复杂的网络调控机制［1，9-10］. 但目前有关全麻药的中枢作用机制尚未从基因水平上揭示，而传统的RTPCR，Southern Blot等基因表达研究方法难以同时获得足够信息，更无法了解基因间的相互关系. 本研究我们应用U34芯片对单次注射异丙酚大鼠丘脑基因表达谱进行了全景式研究，结果发现，在1323条待测基因中，异丙酚麻醉后221条基因差异表达，其中上调表达80条，差异表达超过两倍的为53条. 对差异性表达的基因进行生物学功能分析可发现，基因主要涉及离子通道、信号转导、转录因子、细胞因子、凋亡等.

我们发现：①异丙酚可引起多个GABAA受体亚单位基因差异表达，甘氨酸受体、5羟色胺受体、肾上腺素受体等多个配体门控型离子通道基因亦有差异表达. 同时，电压门控型离子通道如Ca2＋，K＋，Na＋亦有差异表达. 结果进一步说明配体和电压门控型离子通道是异丙酚重要作用靶位，而且不同的通道亚单位对异丙酚敏感性不同. ②异丙酚能增加脑PKC活性，而PKC的活性与IP3/Ca2＋和DG/PKC调节相关；抑制NO/cGMP信号转导系统［11-12］. 异丙酚麻醉后，G蛋白、PKC，NOS，IP3等多种信号转导分子及其活性调节分子基因（U21954，AA851136，L09119，J0362）表达上调或下调，说明异丙酚麻醉涉及多个信号传导通路. ③异丙酚麻醉可引起大鼠丘脑众多基因差异表达，说明异丙酚的中枢作用机制涉及多种靶分子和多条神经通路，结果验证了文献报道的异丙酚可能的作用位点并发现了一些新的作用位点，有助于从基因水平认识和理解异丙酚作用机制. 本研究结果表明，基因芯片可以同时检测与全麻药作用相关的众多基因的差异表达，为深入研究全麻药作用机制提供了方便快捷、高通量和并行性的研究工具.

本研究的局限性在于，暂时还不能明确这些基因之间的调控关系和主次关系，若能得到异丙酚不同作用时间基因表达谱，对数据进行聚类等分析，可深入了解异丙酚作用的靶分子和神经通路.

【参考文献】

［1］ Franks NP. Molecular targets underlying general anaesthesia［J］. Br J Pharmacol， 2006，147(Suppl 1): S72-S81.

［2］ Griffin RS， Mills CD， Costigan M， et al. Exploiting microarrays to reveal differential gene expression in the nervous system［J］. Genome Biol， 2003，4(2):105-113.

［3］ 张惠，徐礼鲜，柴伟，等. 应用PET技术探讨咪唑安定对人脑葡萄糖代谢的影响［J］. 第四军医大学学报，2005，26(3):238-241.

［4］ Saab CY， Park YC， AlChaer ED. Thalamic modulation of visceral nociceptive processing in adult rats with neonatal colon irritation［J］. Brain Res，2004，1008(2):186-192.

［5］ Alkire MT， Haier RJ， Fallon JH. Toward a unified theory of narcosis: Brain imaging evidence for a thalamocortical switch as the neurophysiologic basis of anestheticinduced unconsciousness［J］. Conscious Cogn， 2000，9(3):370-386.

［6］ Barrett JC， Kawasaki ES. Microarrays: The use of oligonucleotides and cDNA for the analysis of gene expression［J］. Drug Discov Today， 2003，8(3):134-141.

［7］ Chong VZ， Young LT， Mishra RK. cDNA array reveals differential gene expression following chronic neuroleptic administration: Implications of synapsinⅡ in haloperidol treatment［J］. J Neurochem， 2002， 82(6): 1533-1539.

［8］ Lockhart DJ， Winzeler EA. Genomics， gene expression and DNA arrays［J］. Nature， 2000，405 (6788): 827-836.

［9］ Arhem P， Klement G， Nilsson J.Mechanisms of anesthesia: Towards integrating network， cellular， and molecular level modeling［J］. Neuropsychopharmacology，2003，28 (Suppl 1):S40-S47.

［10］ Grasshoff C， Antkowiak B. Propofol and sevoflurane depress spinal neurons in vitro via different molecular targets［J］. Anesthesiology，2004，101(5):1167-1176.

［11］ Hemmings HC Jr. General anesthetic effects on protein kinase C［J］. Toxicol Lett，1998，100-101:89-95.

［12］ Tonner PH， Scholz J， Lamberz L， et al. Inhibition of nitric oxide synthase decreases anesthetic requirements of intravenous anesthetics in Xenopus laevis［J］. Anesthesiology， 1997，87(6): 1479-1485.