关于脂质体包裹TGF┐α反义脱氧寡核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖

摘 要:目的 研究用转化生长因子α（TGF-α）反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对人大肠癌细胞株HR8348生长增殖的作用，探讨大肠癌治疗的新途径. 方法 采用人工合成的TGF-α反义及无关对照ODN经阳离子脂质体包裹后转染人大肠癌HR8348细胞.采用MTT法，［3 H］-TdR掺入实验，细胞周期分析，裸鼠体内接种等方法测定瘤细胞体内外增殖的变化. 结果 经TGF-α反义ODN处理的HR8348细胞与对照组HR8348细胞相比，体外增殖速度减慢（细胞增殖抑制率达71%），DNA合成受抑，裸鼠体内成瘤率下降（25%vs100%）. 结论 TGF-α反义ODN能有效抑制大肠癌细胞的体内外生长增殖，可用于实验性肿瘤基因治疗研究.

Keywords:colorectal neoplasms;transforming growth factorα;oligodeoxynucleotides;cell line;liposome

Abstract:AIM To investigate the effects of TGF-αanti-sense oligodeoxynucleotides（ASODN）on human rectal carci-noma cell line HR8348.METHODS Cationic liposome and lipofectamine were selected as a delivery vector.HR8348cells were treated with ASODN in vitro.HR8348cells with or without pretreatment were inoculated into nude mice.RE┐SULTS Proliferation and DNA synthesis of HR8348cells treated with ASODN were greatly inhibited and tumorigenic rate was greatly reduced.CONCLUSION TGF-αASODN could inhibit the proliferation of human colon cancer cell line in vitro as well as in vivo.The results implicate the potential value in colorectal cancer gene therapy.

0 引言

转化生长因子α（TGF-α）在多种肿瘤中的过表达促进了瘤细胞的增殖、分裂，并与肿瘤的恶性表性有关

［1］ ，有报道称大肠癌组织中也存在TGF-α的高表达［2，3］ .我们在查明HR8348细胞系存在TGF-α高表达后，用TGF-α反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对其进行细胞转染，研究该反义脱氧寡核苷酸对该细胞系细胞生长的抑制作用.

1 材料和方法

1.1 材料 人大肠癌细胞株HR8348来源于1例男性直肠腺癌患者的手术切除标本，由中国医学科学院肿瘤研究所提供，培养在含100mL・L-1 小牛血清的RPMI1640（Gibco公司）培养液，37℃，50mL・L-1 CO2 的环境中.

1.2 合成硫代寡脱氧核苷酸 TGF-α反义脱氧寡核苷酸（ASODN）由18个碱基组成，与TGF-αcDNA前3个密码子及其上游部位3个密码子碱基序列互补.反义链序列为5’-GGGGACCATTTTACGG-GC-3’;无关对照寡聚核苷酸（N-ODN）由18个碱基随机组合，序列为5’-GCTAGGATCTGGAGCTCG-3’，经基因库检索不与已有的已知编码序列相互补.以上ODN均用硫代磷酸修饰，由本校生物化学教研室合成.

1.3 脂质体┐ODN复合物的制备 阳离子脂质体LipofectAMINE［4］ 购自Gibco公司，制备前将ODN稀释于0.1mL无血清无抗生素的RPMI1640中，加入同样方法稀释的脂质体，混匀，室温放置5～10min，即可形成脂质体-ODN复合物并立即用于细胞处理.脂质体与ODN用量参考说明书.

1.4 细胞处理 用无血清无抗生素的RPMI1640稀释HR8348细胞，接种0.8mL细胞（约1.5×106 个）于35mm培养皿.将脂质体ODN复合物（0.2mL）加入培养皿，充分混匀，添加4mL含血清RPMI1640继续培养48h，而后收集细胞.

1.5 ODN对HR8348细胞生长增殖的影响 采用MTT法及［3 H］-TdR掺入试验.取对数生长期细胞用无血清无抗生素RPMI1640稀释，接种40μL细胞（约1×104 个）于96孔培养板，加入脂质体-ODN复合物，充分混合，培养5h后，添加200μL含血清RPMI1640继续培养48h.而后吸弃上清，以RPMI1640清洗两遍，加入RPMI1640液200μL，MTT（5g・L-1 ）20μL，37℃培养4h后吸弃上清液，每孔加二甲基亚砜（DMSO）200μL，振荡10min，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测其吸光度，每组复设3孔，取均值.设空白对照、阴性对照各1组.另1个96孔板中同上加入细胞及脂质体-ODN复合物，培养5h后添加200μL含血清RPMI1640继续培养24h，向培养液中加入［3 H］-TdR，培养24h后按文献［5］进行测定.

1.6 脂质体为载体对ASODN作用效率的影响 用3’末端标记法将［α-35 S］标记到ASODN上.将细胞（2×10

5 ・mL-1 ）铺种于24孔培养板，加入脂质体包装与未包装的［α-35 S］ASODN，终浓度为10μmol・L-1 ，置37℃50mL・L-1 CO2 孵箱中培养.分别于24，48和72h取出细胞，以PBS洗涤，至上清液放射计数为0.测定细胞中［α-35 S］的放射活性.

1.7 细胞周期动力学分析 将处理细胞经胰蛋白酶消化后，制成1×104 ・L-1 细胞悬液，碘化丙啶（PI）染色，FACScan流式细胞仪测定.

1.8 裸鼠致瘤能力试验 裸鼠11只分成试验组、空白组、阴性对照组，分别为4，3和4只，每只于皮下注射1×107 细胞.

2 结果

2.1 ODN对HR8348细胞DNA合成及生长增殖的抑制 TGF-α反义ODN能抑制HR8348细胞的DNA合成及生长增殖.与空白对照组相比，肿瘤细胞生长增殖的抑制率为71%，［3 H］-TdR掺入实验的抑制率为73%.而经无关对照ODN处理的阴性对照组对HR8348细胞的生长增殖以及DNA合成无 显著抑制.

2.2 HR8348细胞对［α┐35 S］ASODN的摄入 结果表明，细胞对脂质体包装组的［α-35 S］摄入量明显高于未包装组，这种差别随时间延长而更加显著（Tab1）.

表1 HR8348细胞对［α-35 S］ASODN的摄入略

2.3 细胞周期分析 TGF-α反义ODN作用于HR8348后，细胞G0 /G1 期细胞数明显增多，S期细胞数相应减少，而G2 +M期细胞数亦明显的减少，而无关ODN组作用明显减弱，差异明显（Tab2）. 表2 不同处理HR8348细胞周期分析略

2.4 裸鼠皮下移植瘤生长 空白对照组3只及阴性对照组4只所有接种部位均有移植瘤形成且肿瘤体积大，成瘤率为100%（3/3，4/4），TGF-α反义ODN处理4只，成瘤率低下（25%，1/4），且移植瘤生长缓慢，瘤体小（Tab3）.

表3 ASODN对HR8348细胞裸鼠皮下移植瘤形成的影响略

3 讨论

随着分子生物学技术的发展和对癌基因、生长因子及生长因子受体研究的不断深入，人们逐渐认识到生长因子及其受体在介导细胞信号转导、促进细胞分裂和增殖转化中占有重要地位.促瘤形成的自分泌和旁分泌机制的提出，促进了肿瘤发生机制的深入研究.有许多证据证明TGF-α在肿瘤细胞的恶性增殖中起一定作用，在许多恶性肿瘤中都发现有TGF-α的过度表达，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、大肠癌［2］ 及前列腺癌等，TGF-α可与EGFR结合而激活受体的酪氨酸酶活性，从而启动细胞有丝分裂，引起及诱导血管形成和肿瘤生长.已有实验证明，TGF-α可以通过自分泌机制在细胞的癌变中起一定作用［6-10］ .

本结果显示，TGF-α反义ODN对人大肠癌细胞株HR8348的生长增殖和DNA合成均有抑制作用，经TGF-α反义ODN处理后的肿瘤细胞的裸鼠体内致瘤能力明显下降，而经无关对照的ODN处理后的肿瘤细胞无此抑制作用，流式细胞仪的细胞周期分析结果也表明，经TGF-α反义ODN处理的肿瘤细胞生长明显被阻滞于G0 /G1 期，增殖指数（proliferation Index，PI）明显低于其他两组对照组，表明TGF-α反义ODN可阻抑TGF-α与EGFR激活后所促发的细胞向S期过渡及由此导致的细胞过度增殖.TGF-α反义ODN对TGF-α的抑制机制可能为:①直接与TGF-α的mRNA结合诱发内源性核酸酶对杂交体中RNA部分的水解;②封闭酶结合位点;③阻断前mRNA的剪切;④与双链DNA的某一段特异性结合，形成三螺旋结构［11-15］ .

脂质体是由脂质双分子组成的环形封闭囊泡，无毒无免疫原性，使用方便.一些阳离子脂质体更被认为有应用前景［16］ ，因为这些阳离子脂质体一方面可以通过离子吸附方式结合带阴离子的DNA，ODN分子，另一方面又能与细胞作用，通过融合、内吞等方式将所携带的DNA或ODN分子送入细胞.

我们观察了应用人工合成的TGF-α反义ODN对人大肠癌细胞株HR8348的作用.结果表明，TGF-α反义ODN能抑制HR8348的细胞生长增殖和DNA合成，抑制了其在裸鼠体内形成肿瘤的能力.本研究对大肠癌发生机制的探讨和大肠癌的基因治疗有一定的理论意义和潜在的应用价值.

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