关于抗人大肠癌抗体CAb

作者：杨向民，邢金良，姚西英，张思河，陈志南

【关键词】 结直肠肿瘤 【Abstract】 AIM: To identify and express the Fab Fragment against human colorectal cancer in E.coli by cloning the Fab genes of the mAb CAb1. METHODS: Light chain and Fd fragments of MAb CAb1 were amplified by RTPCR and PCR products were sequenced and analyzed after being cloned into pMD18T vector. The expression vector FdL/pComb3 was obtained after subcloning light chain and Fd fragment gene into pComb3 and deleting the gⅢ gene. Then the vector FdL/pComb3 was transformed into XL1Blue E.coli strain and induced by IPTG. The specificity of the expression products was detected by ELISA and immunofluorescence staining methods. RESULTS: The Fab gene of MAb CAb1 was cloned and expressed in E.coli. The expression product CAb1 Fab possessed the activity to combine with cell strain SW480. CONCLUSION: We successfully construct an expression vector FdL/pComb3 to express monovalent Fab against human colorectal cancer. 【Keywords】 colorectal neoplasms; Fab genes; clone; expression 【摘要】 目的：从杂交瘤细胞中克隆mAb CAb1所编码Fab抗体基因，并在大肠杆菌中进行表达和鉴定. 方法：采用RTPCR方法，扩增mAb CAb1的Fd片段和全长κ链基因，分别克隆到T载体后进行序列测定和分析. 依次亚克隆两个基因到噬粒pComb3中，去除该载体上的gIII基因，构建成分泌表达载体FdL/pComb3. 转化XL1Blue E.coli菌株，IPTG诱导表达. 采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性. 结果：克隆了大肠癌mAb CAb1的Fab基因，并在E.coli中获得表达. 产物CAb1 Fab具有与大肠癌细胞株SW480特异结合的活性. 结论：成功构建了在E.coli中表达抗人大肠癌mAb CAb1的小分子单价Fab抗体的载体. 【关键词】 结直肠肿瘤； Fab抗体；克隆；表达 0引言 我国大肠癌发病率有增高的趋势［1］. 随着工程抗体技术的发展，mAb用于大肠癌的诊治获得了较大的进展. 采用放射性核素标记Fab抗体可使核素很好地在肿瘤组织浓聚，减少药物的毒副作用，为早期微小病灶和肿瘤的复发和转移治疗提供了有效的手段［2］. 因此我们通过对已制备的杂交瘤细胞株mAb CAb1的Fab基因进行克隆、表达和鉴定如下. 1材料和方法 1.1材料 杂交瘤细胞株［3］、表达载体pComb3及E.coli感受态菌株JM109和XL1Blue均为本室保存. Trizol为Gibco公司产品. cDNA第一链合成试剂盒购自Promega公司. TA克隆试剂盒、PCR试剂盒及限制性内切酶和连接酶，均为Takara产品. IPTG，FITC和HRP标记的羊抗鼠IgG购于华美公司. 1.2方法 收集处于对数生长期的CAb1杂交瘤细胞1×107，应用Trizol试剂提取总RNA，具体步骤参照试剂说明书进行. 最后一步选用100 μL DEPC处理的ddH2O溶解RNA，紫外法测定总RNA的浓度，甲醛变性电泳观察. 所余样品置于-70℃保存备用. 寡核苷酸引物设计参照文献［4］，设计克隆Fab基因的PCR引物，由上海申友公司合成. 用于扩增鼠κ轻链的PCR引物共6条：MKV1 5′GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT3′; MKV2 5′GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3′; MKV3 5′GGGGATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA3′; MKV4 5′GGGGATATCCACCATG(GT)CCCC(AT)(AG)CTCAG(CT)TC(CT)CT(TG)GT3′; MKV5 5′GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG3′; MKC 5′GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA3′. 用于克隆鼠重链Fd的PCR引物5条：MHV 1 5′GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3′; MHV 2 5′GGGGATATCCACCATG(AG)ACTTCGGG(TC)TGAGCT(TG)GGTTTT3′; MHV 3 5′GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT3′; MHFR1 5′AGGT（GC）(AC)A(GA)CT(GT)CTCGAGTC(AT)GG3′; MHCG1 3′5′AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT3′. 用于剔除轻链假基因和构建FdL/pComb3基因的特异引物pseudoCDR1 5′TCTGGCTATAGTTATATGCAC3′; pseudoCDR3 5′TGTAAGCTCCCTAATGTGCTG3′; MKVBACK 5′GATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC3′. 其中，划线处为限制性酶切位点， 依次为：EcoRⅤ， SacⅠ， XbaⅠ， XhoⅠ， SpeⅠ. 1.2.1CAb1 Fab基因的克隆cDNA反转录体系：总RNA (2 μL) 1 μg，随机引物Oligo(dT)15 0.5 μg (1 μL)， MgCl2 (25 mmol/L) 4 μL， 5×dNTPs 2 μL， 10×缓冲液2 μL， RNase抑制剂0.5 μL，反转录酶AMV 15 U（0.75 μL），用水补至20 μL，其余步骤参见试剂盒进行. 取cDNA 2 μL为模板，用相应的配对引物扩增全长轻链和Fd基因，其余步骤参照PCR试剂盒说明书. 对轻链基因PCR产物，用引物pseudoCDR1，3进行PCR鉴定. 将轻链和Fd基因与pMD18T载体连接，转化JM109感受态细胞，获得克隆载体pMD18T/Fd和pMD18T/L. 对上述载体进行序列测定和分析. 选用NCBI和IMGT数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/；http://imgt.cines.fr:8104/cgibin/IMGTdnap.jv）进行结果分析. 1.2.2CAb1 Fab基因表达载体的构建选用引物MKVBACK和MKC，以pMD18T/L为模板，进行轻链的扩增（去掉肽部分，并引入正确的酶切位点），纯化定量后，选用Sac I+Xba I消化与双酶切的pComb3连接，转化并筛选鉴定. 然后，用Xho I+Spe I双酶切pMD18T/Fd，亚克隆Fd至pComb3/L，获得展示型载体pComb3/FdgIIIL，以Spe I+Nhe I酶切gIII，用T4 DNA连接酶将其环化为分泌型的表达载体FdL/pComb3. 1.2.3Fab基因的表达及鉴定挑取含FdL/pComb3单菌落，接种于5 mL 2×YTAG（含Amp 100 mg/L，2 g/L glucose）30℃过夜培养. 次日1%转接种于2×YTAG中，至A600 nm为0.8，5000 r/min离心10 min，弃上清，用2×YTI 200 mL (含Amp 100 mg/L，IPTG 0.8 mmol/L) 重悬菌体，30℃ 诱导培养24 h. 收集菌体，用适量PBS重悬，反复冻融，离心收集上清，过0.45 μm滤膜后，4℃保存备检. 以羊抗鼠IgG（10 mg/L）包被ELISA板，加50 g/L脱脂奶粉37℃封闭1 h，加入诱导空菌XL1Blue和FdL/pComb3转化未诱导菌及诱导菌的冻融离心上清50 μL，PBS作为空白对照. 加入HRP羊抗鼠IgG后，以TMB为底物显色，检测A450 nm值.