关于酪氨信号放大间接免疫荧光组织化学方法

作者：鲍岚焦西英程希平张旭

【关键词】 荧光抗体技术

关键词: 荧光抗体技术;激光;显微镜检查

0 引言

免疫组织化学方法是对细胞及细胞内的某种抗原物质进行定性、定位或定量检测的方法.随着标记技术的不断改进，使得免疫组织化学方法检测的敏感性大大增强;随着显微镜技术的发展，且与计算机技术的不断结合，可以对抗原物质作更加精确和全面的定位.我们应用酪氨信号放大间接免疫荧光组织化学方法，并结合激光共聚焦显微镜术对脑动脉Y1 受体免疫反应物质分布进行了观察.

1 材料和方法

1.1 酪氨信号放大间接免疫荧光组织化学方法 11只SD大鼠（200～250g），戊巴比妥钠（50mg・kg-1 ，ip）麻醉，经心脏灌注37℃生理盐水50mL和37℃的40g・L-1 多聚甲醛和2g・L-1 苦味酸磷酸缓冲固定液50mL，再灌注4℃同样固定液250mL，取大鼠全脑，在同样固定液中后固定1.5h，200g・L-1 蔗糖浸泡24h以上.4只大鼠分离其脑底部表面脑动脉，尽可能分离到最细的分支，有大脑前动脉、大脑前内动脉、大脑中动脉、颈内动脉、大脑后动脉、小脑上动脉、基底动脉和椎动脉及其分支;从其他3只大鼠片下脑底部的表层脑组织，其中含有完整的脑表面血管网.

根据酪氨信号放大间接免疫荧光组织化学方法，对大鼠剥离的脑底部表面分离的脑动脉和片下的有脑表面血管网的表层脑组织进行组织处理.第一抗体为针对Y1 受体C末端肽片段（氨基酸序列为355～382）的纯化兔抗血清（1∶8000）［1］ .使用Dupont NEN TSA-Indirect Tyramide Signal Amplification Kit（Dupont，NEN Research Products，Boston，MA.USA），具体步骤如下:在TNB缓冲液中封闭切片30min，室温（脑表面组织片为60min）↓在湿盒内将组织用第一抗体孵育1d，4℃（脑表面组织片为3d）↓TNT缓冲液洗15min（3×5min），室温（脑表面组织片为30min）↓在湿盒内将切片置于HRP标记的猪抗兔IgG中（1∶100）孵育30min，室温（脑表面组织片为1∶200，60min）↓用TNT缓冲液洗15min（3×5min），室温（脑表面组织片为30min）↓在湿盒中用Biotinyl Tyramide（1∶50）孵育3～10min，室温（脑表面组织片为1∶100，30min）↓用TNT缓冲液洗15min（3×5min），室温（脑表面组织片为30min）↓在湿盒中用Streptavidin fluorescence孵育30min（TNB配制），37℃（脑表面组织片为60min）↓用TNT缓冲液洗15min（3×5min），室温（脑表面组织片为30min）↓封片

注:TNT缓冲液为:0.1mol・L-1 Tris-HCl（pH7.5），0.15mol・L-1 NaCl，0.5mL・L-1 TWEEN20;TNB缓冲液为:0.1mol・L-1 Tris-HCl（pH7.5），0.15mol・L-1 NaCl，0.5g・L-1 DuPont Blocking Reagent.

1.2 激光共聚焦显微镜术 用Bio-Rad MRC-600激光共聚焦显微镜观察组织切片，激发光波长为488nm，观察异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Y1 受体-LI.在观察分离脑血管和片下的脑表层组织时，使用激光共聚焦显微镜特有的功能“光学切片（optic section）”.特别是在观察脑表面动脉时，将凹凸不平的脑组织的最上面定为零平面，由此平面向下每隔5μm得到一幅图像（切片），随脑表面起伏向下50～100μm，得到10～20幅图像，将这些图像在原位进行叠加，得到一幅各个平面都聚焦清楚的叠加的图像，避免了厚片聚焦不清的缺点，在一张叠加图片上形成被扫描区域内完整的脑表面血管中Y1 受体的免疫反应阳性标记. 2 结果

在分离的各级动脉中均可见Y1 受体免疫反应阳性和Y1 受体免疫反应阴性平滑肌细胞呈不规则间隔地出现，这样的间隔分布特征在激光共聚焦显微镜下更加明显（图1a），同时观察到Y1 受体免疫反应阳性物质主要存在于靠近血管外膜面的平滑肌细胞膜附近的细胞质中，血管中两个平滑肌细胞侧面相邻面的细胞膜附近的细胞质中Y1 受体免疫反应阳性标记强度也较高（图1b）.

片下的脑表面组织的激光共聚焦显微镜分析表明:Y1 受体免疫反应阳性强标记分布在脑底表面直径为15～30μm的微动脉，主要为中动脉、前和后动脉的第2、3级分支及直接从基底动脉发出的小分支，免疫染色的强度随动脉管径进一步变小直径（<10μm）而下降，沿着主要动脉的第2级分支可观察到弱的Y1 受体免疫反应阳性标记（图2）.

图1 － 图2 略

3 讨论

在研究Y1 受体在脑动脉中的分布时用了TSA免疫荧光组织化学方法，这种方法是在原有的免疫荧光组织化学方法的基础上，中间增加了两步信号放大过程，即HRP标记的猪抗兔IgG和生物素化的酪氨的孵育过程，提高了检测的敏感性.但有时也同时提高了荧光背底的强度，因此在原本免疫荧光标记背底较高的组织，如心脏组织则不能用此方法.

在本研究中应用了激光共聚焦显微镜技术，由于激光共聚焦显微镜的高分辨率，在观察细胞时所能看到的结构介于普通的光学显微镜和电子显微镜之间，但它仍然不能区分各种细胞器.由于激光共聚焦显微镜的高分辨率与计算机技术的结合，赋予了显微镜一些特殊的功能，如“光学切片”等，可以在普通显微镜无法很好观察或根本无法观察时，得到很好的图像，如在本实验中由于脑表面高低不平，很难观察完整的脑血管系统中Y1 受体免疫反应阳性标记在脑动脉中分布情况，我们用激光共聚焦显微镜可以做连续扫描，采用“光学切片”的特点，将数十张“光学切片”叠加，形成完整的脑表面血管分布图，得到了非常好的研究结果.同时，用激光共聚焦显微镜来分析Y1 受体免疫反应阳性物质在血管平滑肌内的分布，可以更为整体地阐明Y1 受体免疫反应阳性物质在细胞内的区域性分布特征.

［1］Zhang X，Bao L，Xu ZQ etal.Localization of neuropeptide Y Y1 receptors in the rat nervous system with special reference to so-matic receptors on small dorsal root ganglion neurons ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91（24）:11738-11742.