云南白药对血小板的释放与代谢反应的影响

作者：唐正龙， 王兴，伊彪， 李自力， 梁成

【摘要】 目的： 研究云南白药对血小板颗粒内容物释放和代谢反应的影响，探讨其止血和抗炎机理。方法： 87例正颌外科手术患者随机分为试验组(43例)和对照组(44例)，分别在术前3日口服云南白药胶囊和安慰剂胶囊；采集术前和术中静脉血，用酶联免疫吸附法测定手术开始前和术中血浆11-去氢-血栓烷B2 (11DehydroThromboxane B2， 11DHTXB2)水平；分离和固定血小板，观察血小板超微结构和颗粒内容物的改变。结果： 术前实验组血浆11DHTXB2（58.83±15.89）ng/L，对照组(69.54±14.43)ng/L，两组比较差异无统计学意义；术中实验组11DHTXB2(90.41±38.97)ng/L，对照组(131.78±78.92)ng/L，两组差异有统计学意义；实验组术中血小板内α-颗粒数目减少，两组比较具有统计学差异。结论： 云南白药抑制血小板11DHTXB2的生成，反映了血栓烷A2生成减少，不会增加手术区域微血管的收缩，可能有利于改善术后局部血液循环;在手术刺激诱导下云南白药可促进血小板颗粒内容物的释放，有利于提高术中凝血功能，减少手术中出血量。

【关键词】 云南白药；血小板活化；血小板聚集；细胞结构

［Abstract］Objective: To observe the changes of platelet release and metabolic reaction after administration of Yunnan Baiyao in orthognathic surgery and to investigate the haemostasis and antiinflammation mechanisms of Yunnan Baiyao. Methods: Eightyseven patients scheduled for bimaxillary orthognathic surgery were enrolled in the prospective， randomized clinical study. Patients were orally administrated with Yunnan Baiyao capsules (group YB， n=43) or placebo capsules (group C， n=44) 3 days before operation. Plasma levels of 11DehydroThromboxane B2 （11DHTXB2） were determined using ELISA pre and intraoperation. The intraoperative ultrastructural aspects and the αgranules number of blood platelets were also observed with electromicroscope. Results: The preoperative plasma level of 11DHTXB2 in group YB (58.83±15.89 pg/ml) was lower than that of group C (69.54±14.43pg/ml)， but the difference was not significant. The intraoperative plasma level of 11DHTXB2 in group YB was significantly lower than that in group C (90.41±38.97 pg/ml vs. 131.78±78.92 pg/ml). The intraoperative average number of αgranule in group YB was also significantly lower than that in group C. Conclusion: The administration of Yunnan Biayao capsules inhibits the metabolic production of blood platelet 11DHTXB2 reflecting the decrease of thromboxan A2 which does not increase the microvascular shrink in operation area， but would improve the local postoperation blood circulation.Yunnan Baiyao Capsules can promote the release of platelet αgranule after the stimulation of operation which benefits the rise of blood clotting.

［Key words］ YUN NAN BAI YAO; platelet activation; platelet aggregation; cellular structures 临床研究显示云南白药具有止血、抗炎和消肿作用[1～3]，但其止血和抗炎作用机理尚不清楚。血小板膜磷脂代谢和颗粒内容物的释放在凝血和其它功能作用中起重要作用，本研究观察口服云南白药胶囊后血小板超微结构改变，并检测11-去氢-血栓烷B2（11DehydroThromboxane B2， 11DHTXB2）水平变化，探讨云南白药胶囊对血小板释放和代谢反应的影响及机理。

1 对象和方法

1.1 对象 病例来自2006年7月～2007年8月在北京大学口腔医学院口腔颌面外科就诊的牙颌面畸形患者，术式为Le FortⅠ型截骨术和双侧下颌升支矢状劈开截骨术，患者年龄18～35岁，无全身系统性疾病及凝血功能异常，患者入选前均签署了知情同意书。受试者根据数字表随机分为实验组和对照组，分别于术前口服云南白药胶囊和安慰剂胶囊。术前连续口服3天试验药物，每次2粒（0.5 g），每日4次(共2.0 g)，试验药物由云南白药集团股份有限公司提供。两组受试者性别构成、年龄、体重、身高和凝血功能等术前指标比较无统计学差异（表1）。表1 两组患者术前和术中基本资料比较（略）注：PT为凝血酶原时间，APTT为活化部分凝血酶原时间。

1.2 方法

1.2.1 血液标本采集

在麻醉后手术开始前和术中完成Le FortⅠ型截骨术后采集静脉血各2 ml，采血组件为奥地利格雷拉公司生产的真空采血管针(Greiner bioone，Austria)，抗凝剂为按1∶9稀释的枸橼酸钠。

1.2.2 血小板分离与固定

将采集的静脉血在常温下立即3 000 r/min离心10 min，小心取出上层血浆，置-70 ℃冰箱中保存，作11DHTXB2检测。勿搅动中间呈白膜状的血小板层（富血小板血浆层）。然后沿管壁缓慢加入0.5%戊二醛固定液，置4 ℃冰箱中静置30 min，初步固定已分层的血小板。待血小板层呈凝胶状态后小心取出凝胶层放入离心管中，再加入3%戊二醛固定液固定4 h作进一步的包埋处理。

1.2.3 血小板超微结构观察

血小板凝胶用1%锇酸固定，酒精逐级脱水(体积比70%～100%)，Epon812环氧树脂包埋，制成5 μm半薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色后在电子显微镜(JOEL 100， Japan)下观察血小板超微结构。每例切片随机选择10个视野，在相同放大倍数下随机计数20个血小板内α-颗粒数目。

1.2.4 血浆11DHTHB2测定

采用酶联免疫法检测血浆中11DHTXB2（试剂盒为Cayman公司产品，美国），操作程序严格按照产品说明书进行。先将标准品及待测样品均用11DHTXB2 Buffer缓冲液稀释后置室温中保存2 h，然后在96孔酶标板（鼠单克隆抗体包被，蛋白封闭）中依次加入倍比稀释的11DHTXB2标准品（从500 ng/L开始稀释，共8点）或待测血浆（11DHTXB2 Buffer 稀释2倍）各50 μl，兔抗11DHTXB2抗体和乙酰胆碱酯酶标记的11DHTXB2各50 μl。在11DHTXB2抗体量不足的情况下，酶标11DHTXB2标准品或待测血浆中的11DHTXB2竞争性地与之结合后，再与包被在酶标板上的鼠源性单抗结合。混匀置室温孵育2 h后，倾弃孔内液体，用wash buffer洗涤5遍，各孔加酶底物（Ellman试剂，现配）200 μl，避光置摇床上显色60～90 min。用酶标仪在λ=405 nm处测定吸光度，11DHTXB2浓度由全自动酶标仪（Triturus， Spain）根据标准曲线自动计算获得。

1.3 统计学处理 所有结果以（x±s）标准差表示，统计软件采用SPSS for windows 13.0。根据资料性质采用MannWhitney检验、T检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 所有受试者在术中术后均无不良事件发生，两组患者血浆11DHTXB2水平见表2。血小板超微结构观察显示，两组血小板形态保存完整，细胞器结构清晰，α-颗粒数目较多且容易辨认，血小板超微结构均未见异常。两组术前血小板结构和α-颗粒数目无统计学差异，但实验组术中血小板内α-颗粒数目减少，α-颗粒相对聚中，且血小板内开放管道系统增多(图1，2)。实验组血小板内平均α-颗粒数为（12.3±3.7）个，对照组血小板内α-颗粒平均为（18.4±7.6）个，两组血小板内α-颗粒数目比较具有统计学差异（P＜0.05）。表2 两组患者血浆11DHTXB2水平比较（略）

3 讨论 血小板受到生理刺激时，储存在致密体、α颗粒和溶酶体内的许多物质即可释放到细胞外。致密体内主要有ADP、5HT、钙离子等，α颗粒内容物主要有β-血小板球蛋白、血小板第4因子、凝血因子Ⅴ、血管性血友病因子等[2]。致密体内容物在受到弱刺激物如ADP、低浓度胶原作用下即可引起释放，而溶酶体内容物要在强刺激物作用下才可引起释放。血小板的许多释放产物可以进一步引起血小板的活化与聚集，如ADP、血栓烷A2 (Thromboxane A2， TXA2)。在血小板释放反应中，某些颗粒膜蛋白或特异的蛋白质被释放到血浆中或出现在血小板膜表面，这些蛋白质已被作为血小板活化的分子检测物，如存在于α颗粒上的GMP140，在血小板活化时与血小板表面的质膜融合，并在血小板膜上表达或出现在血浆中，而在静息血小板上GMP140极少。正常生理刺激条件下，血小板内α颗粒数目减少标志着血小板处于活化状态[4]。 血小板花生四烯酸代谢的主要活性产物是TXA2，它很不稳定，半衰期仅30 s，很快转变成稳定的无活性的TXB2。但TXB2并不是最终产物，它在体内经肝脏酶的作用进一步氧化代谢，最终形成2，3-去二甲基-TXB2和11DHTXB2。一般采用气相色谱-质谱法、应用放射免疫法或酶标法测定血浆中TXB2的浓度来代表体内TXA2的生成，了解体内血小板活化的情况。但采血取样过程以及随后的实验操作极易导致血小板的体外活化，血小板在体外产生TXB2的能力很强，可达300～400 μg/L，比正常血浆的TXB2浓度高几千倍。因此，少数血小板在体外活化就可能影响血浆TXB2的测定结果，不能真实反映体内血小板的活化情况。理论上，TXB2的体内酶代谢产物不在血液中形成，能真实反映体内TXA2的生成水平。有研究表明，血小板的体外活化并不影响11DHTXB2的浓度，认为11DHTXB2可作为一项反映体内TXA2生成水平的可靠指标 [5，6]。近年来国内外已普遍采用11DHTXB2测定代替TXB2作为体内血小板活化的指标 [7，8]。 云南白药是止血中药，Chew[9]观察发现云南白药可引起血小板释放，从而起到止血作用。张小梅等[10]研究云南白药对围手术期病人血小板表面糖蛋白的表达及血小板超微结构有影响，服用云南白药后，血小板表面糖蛋白表达增加，活化血小板增多，血小板表面突起增多，血小板小管开放，释放增多，提示服用云南白药能增加血小板活性、血小板聚集及与纤维蛋白原受体的结合能力。杨吉林等[11]研究发现骨科手术病人术前2日口服云南白药胶囊后，可使血小板激活，血小板细胞表面羽状突起增多，胞质内颗粒因排空而减少，开放小管增多且管腔扩大，腔内可见排放的颗粒，血小板胞质内还可见α-颗粒排空减少。 本研究通过观察口服云南白药胶囊后血小板的超微结构变化和检测11-DHTXB2水平变化，研究云南白药胶囊对血小板释放和代谢反应的影响。结果显示，口服云南白药胶囊后，在手术刺激下，血小板内α颗粒数量减少，开放管道系统增加，说明血小板释放功能加强，增加了凝血功能，从而有利于术中更快止血。然而，口服云南白药胶囊后血浆11DHTXB2含量反而较对照组减低，提示血小板膜磷脂代谢反应被抑制，这可能与云南白药具有促进机体凝血作用的机制有关。实验组血浆11DHTXB2水平低，间接反映了血浆中TXA2的生成较低，而TXA2为强烈的缩血管物质和促进血小板聚集的物质，术后持续的TXA2升高对组织肿胀的消退不利，并可能导致异常血栓形成。口服云南白药胶囊后抑制了TXA2的生成，减轻了术后局部组织中微血管的收缩反应，改善了微循环状况，可能有利于术后组织肿胀的消退。由于云南白药中含有多种生物活性物质，其止血作用可能并不是单纯通过增强血小板的TXA2代谢反应，促进血小板的聚集途径来完成的，需通过其它途径做进一步研究。 本研究显示，在手术刺激条件下，血小板内α颗粒释放增加，数目减少，提示云南白药胶囊可促进术中血小板的活化，有利于手术中止血，从而减少了术中出血量。同时服用云南白药后抑制了血小板膜磷脂代谢，血浆11DHTXB2水平减低，反映了具有强烈收缩血管作用的TXA2生成也减少，可能对改善术后手术创伤区域组织微循环有利，加快肿胀组织消退。