关于胃癌耐药细胞系传统型蛋白激酶C的表达及活性

作者：韩英时永全郑悦张宏博樊代明

【关键词】 蛋白激酶

关键词: 蛋白激酶C;同工酶;胃癌;多药耐药

摘 要:目的 观察传统型蛋白激酶C（cPKCs）在胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR1.0、耐药亚系SGC7901/VCR0.3，SGC7901/VCR0.7及药敏细胞系SGC7901表达及活性的变化，以及对细胞内药物浓度的影响. 方法 用免疫荧光化学及蛋白印迹方法观察传统型蛋白激酶C在胃癌耐药细胞系及药敏细胞系的表达;竞争蛋白结合法测定PKC的活性;应用流式细胞仪观察细胞内药物浓度的变化. 结果 PKCα，PKCβⅠ ，PKCβ Ⅱ 及PKCγ在胃癌耐药细胞系及药敏细胞系均有表达，PKCα在耐药细胞表达呈强阳性，在药敏细胞表达呈阳性;PKCβⅠ 及PKCβⅡ 在耐药细胞及药敏细胞表达均为阳性;PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均为强阳性.免疫蛋白印迹实验证实，随耐药指数的增加，PKCα表达呈逐渐增高的趋势，薄层扫描蛋白印迹带的吸光度（A）分别为9584.17，9421.06，8534.64，8088.79，而PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ在耐药细胞系、耐药亚系及其药敏细胞系表达无明显变化.PKC活性检测结果提示，随耐药指数的增加，PKC活性呈逐渐增高的趋势，以细胞质及细胞核的PKC活性增高为主. 结论 传统型蛋白激酶C在维持胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR的多药耐药中起重要作用且具有同工酶特异性.

Keywords:protein kinase C;isoenzyme;gastric cancer;mul-tidrug resistance

Abstract:AIM To observe the expression and activity of classic protein kinase C in gastric cancer cell SGC7901and its drug-resistant sublines SGC7901/VCR slected by vincristine of different concentration（0.3，0.7and1.0μg・mL-1 ）.To explore the effect of classic protein kinase C on drug concen-tration within gastric cancer cells.METHODS The expres-sion of classic protein kinase C in gastric cancer cells was de-termined by immuno-fluorescent method and Western blot.The PKC activity was determined by competed protein bind-ing method.The drug concentration within cells was deter-mined by FACS.RESULTS Both SGC7901and SGC7901/VCR cells exhibited positive staining of PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ and PKCγ.The staining of PKCαin SGC7901/VCR was much stronger than that in SGC7901.There were no dif-ferences in the expression of PKCβⅠ ，PKCβⅡ and PKCγbe-tween SGC7901and SGC7901/VCR.By using Western blot，continuous increasing expression of PKCαin SGC7901/VCR was demonstrated along with the increasing resistant index，as well as no differences between SGC7901and its drug-resis-tant sublines.Results of activity assay showed continuous in-creasing activity of PKC in gastric cancer cells along with in-creasing resistant index.CONCLUSION Classic protein ki-nase C plays an important role in multidrug resistance of gas-tric cancer cells with isoenzyme specificity.

0 引言

蛋白激酶C是一类广泛分布的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，目前发现至少有12种同工酶亚型.按其生化性质及结构可分为四大类.由钙、磷酯（PL）、二酰基甘油（DAG）或佛波酯激活的PKC为传统型（cPKCs）;不依赖钙而由PL，DAG或佛波酯活化的PKC类为新型（nPKCs）;仅由PL类物激活的为非典型型（aPKCs）;PKCμ不需钙、DAG激活，而由磷酯酰肌醇-4，5二磷酸激活，但在结构上与前三种部分类似，故称为第四种PKC［1，2］ .PKC具有异质性，不同的PKC亚类位于不同类型的细胞以及同一细胞内的不同部位，因而表现出不同的功能.近期研究提示，cPKCs可能参与了多药耐药的形成且具有同工酶特异性.本研究拟观察cPKCs在胃癌耐药细胞系、耐药亚系和药敏细胞系的表达及活性的变化以及对细胞内药物浓度的影响，以进一步揭示信号转导分子PKC在多药耐药发生中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 SGC7901细胞系由军事医学科学院惠赠，耐药细胞系SGC7901/VCR1.0及其耐药亚系SGC7901/VCR0.3，SGC7901/VCR0.7由本室诱导.兔抗人PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司;羊抗兔IgG-FITC购自中山公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自武汉博士德公司;PKC活性分析试剂盒购自Gibcobrl公司;［γ-32 P］ATP购自北京亚辉公司.细胞生长于含100mL・L-1 已灭活小牛血清的RP-MI1640培养液中，37℃，50mL・L-1 CO2 的条件下培养，耐药细胞培养液中分别加入0.3，0.7和1mg・L-1 长春新碱以维持耐药表型，用于实验前耐药细胞在不加长春新碱的培养液中培养2wk.

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光化学 取对数生长期的耐药细胞SGC7901/VCR及药敏细胞SGC7901，用2.5g・L-1 的胰酶消化传代于装有载玻片的培养皿中，培养24h后，用PBS冲洗3次，冷丙酮固定［3，4］ .PBS洗3次，加50mL・L-1 H2 O2 室温15min，水洗3次;3mL・L-1 Triton X-100室温15min，吸去不洗;1∶10的血清封闭30min，吸去不洗;分别加兔抗人多克隆抗体PKCα（2mg・L-1 ），PKCβⅠ （2mg・L-1 ），PKCβⅡ （4mg・L-1 ）及PKCγ（4mg・L-1 ），37℃孵育1h，PBS洗3次;加羊抗兔IgG-FITC（1∶60），37℃孵育1h，PBS洗3次，用500mL・L-1 的缓冲甘油封片.实验同时设PBS或无关抗体为替代一抗的阴性对照.

1.2.2 Western blot 收获对数生长期的细胞并用冷PBS清洗2次，以裂解缓冲液［50mmol・L-1 Tris-Cl（pH7.5），150mmol・L-1 NaCl，0.2mmol・L-1 EDTA，1mmol・L-1 PMSF和10g・L-1 NP-40］裂解细胞制备细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度;取150μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上，丽春红S染色并标记蛋白分子质量标准;去离子水漂去丽春红后以50g・L-1 脱脂奶粉于室温1h封闭滤膜，常规分别结合兔抗人PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ多克隆抗体、辣根过氧化物 酶标记的羊抗兔IgG，最后以DAB显色目的条带.

1.2.3 PKC活性检测 参照文献［5］并进行改良取对数生长期的耐药细胞系、耐药亚系及药敏细胞系，用2.5g・L-1 的胰酶消化传代于10cm的培养皿中，至对数生长期，冷PBS冲洗2次后，用细胞刮收取细胞，加Buffer A1mL（Tris/EGTA/EDTA，β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂），用超声粉碎机粉碎，每次20s，共3次，然后1000g离心15min，沉淀部分超声粉碎后12000g离心10min，所得上清为细胞核部分;上清100000g4℃离心1h，所得上清为细胞质PKC部分;所得沉淀部分加含10mL・L-1 Triton X-100的BufferA抽提细胞膜PKC30min，每10min震荡1次，然后进行超声粉碎.蛋白定量用Bradford法，活性检测步骤按试剂盒要求进行，所测活性为cPKCs的总活性，PKC比活性用nmol・g-1 ・min-1 表示.

1.2.4 流式细胞仪检测细胞内药物浓度 参照文献［6，7］进行.取对数生长期细胞用2.5g・L-1 胰酶消化成单细胞悬液，接种6孔板并继续培养48h.加阿霉素至终浓度为5mg・L-1 ，继续培养1h，冷PBS洗3次，用细胞刮收获细胞离心，再以冷PBS重新悬浮，保存于4℃，上流式细胞仪检测.激发波长为488nm，接收波长为575nm.

统计学处理:用方差分析.

2 结果

2.1 免疫荧光化学 PKCα在耐药细胞系SGC7901/VCR表达呈强阳性，在药敏细胞系SGC-7901表达呈阳性;PKCβⅠ 及PKCβⅡ 在耐药细胞及药敏细胞表达均呈阳性;PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈强阳性.

2.2 Western blotting PKCα在耐药细胞系及耐药亚系较其药敏细胞系表达明显增加，随耐药指数的增加PKCα表达呈逐渐增加的趋势，薄层扫描蛋白印迹带的吸光度（A）分别为9584.17，9421.06，8534.64和8088.79（Fig1）.PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ在耐药细胞及药敏细胞无明显差异（Fig1）.

2.3 PKC活性检测结果 胃癌耐药细胞SGC7901/VCR及其耐药亚系与其药敏细胞比PKC活性明显增高，其中以细胞质及细胞核PKC活性增高比较明显（Tab1）.

2.4 细胞内药物浓度 胃癌耐药细胞SGC7901/VCR及其耐药亚系与其药敏细胞系比细胞内药物浓度明显减低，且具有统计学意义（P<0.01），随耐药指数的增加细胞内阿霉素的浓度呈逐渐减低的趋势. 图1 略

表1 胃癌耐药细胞系及其药敏细胞PKC活性略

3 讨论

传统型蛋白激酶C，即钙、磷酯依赖的蛋白激酶C，包括4种同工酶亚型PKCα，PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ，Mr 80000～90000.cPKCs亚型分布有明显的组织特异性，如胰腺表达PKCα，PKCβⅡ ，而无PKCβⅠ 及PKCγ的表达;肾上腺皮质和髓质细胞表达PKCα，而间质细胞表达PKCβⅠ 和PKCγ;人白血病细胞表达PKCα，PKCβ和PKCγ.不同PKC亚型选择性器官分布提示它们在功能上的差异，多种亚型可在同一组织甚至同一细胞中存在，并介导不同的信号传递功能.我们观察了cPKCs在胃癌耐药细胞系及其药敏细胞系的表达［8］ ，PKCα在耐药细胞表达呈强阳性，在药敏细胞表达呈阳性;PKCβⅠ ，PKCβⅡ 在耐药细胞及药敏细胞表达均呈阳性;PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈强阳性.蛋白印迹实验证实，随耐药指数的增加，PKCα的表达呈逐渐增高的趋势，而PKCβⅠ ，PKCβⅡ 及PKCγ在耐药细胞及药敏细 胞的表达无明显差异.提示PKCα在维持胃癌细胞的耐药表型中可能起重要作用.

有研究表明，在体外建立的耐药细胞株，较相应的敏感株蛋白激酶C活性明显增高［9］ .近年来也有研究表明耐药细胞系PKC的表达及活性较其药敏细胞系减低，但有趣的是这些细胞的基础PKC表达及活性水平与细胞耐药后PKC活性增高的细胞比高出许多倍，提示如果PKC活性的基础水平比较高，MDR表达不一定伴有PKC活性的增高［10］ .上述事实说明，肿瘤细胞获得MDR后，PKC活性的改变可能取决于亲代细胞本身的特性以及所诱导的药物类型.我们检测了胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR1.0，SGC7901/VCR0.7及SGC7901/VCR0.3及其药敏细胞SGC7901的PKC活性，提示细胞耐药后PKC总活性、细胞质及细胞核的活性明显增高，随耐药指数的增加呈逐渐增高的趋势，细胞膜的PKC活性无明显改变.可能是因为化疗药物长期诱导耐药细胞导致PKC的表达增加，而PKC通常以无活性的形式存在于细胞质，无化疗药物及其他刺激时细胞质内的PKC含量较多，所以检测到的结果细胞耐药后细胞质内PKC的活性较高而细胞膜的活性无明显变化，细胞核内PKC活性的增高可能与维持MDR表型蛋白的基因转录与表达有关.

MDR经常与PKC的水平和活性有关.从我们的实验结果也可以看出，PKC活性水平的升高与PKCα的表达有明显的相关性，随耐药指数的增加PKC的活性及PKCα的表达呈逐渐增高的趋势，细胞内药物浓度呈逐渐减低的趋势，更进一步说明PKCα在维持胃癌细胞的耐药表型中起重要作用.无论如何，对于PKC不同同工酶亚型与胃癌多药耐药性相关性的研究，为进一步明确胃癌的多药耐药机制以及选择逆转耐药的药物将会提供有益的帮助.

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