健康家兔服用大川芎丸后体内阿魏酸的药代动力学研究

【摘要】 目的 建立健康家兔服用大川芎丸后血清中阿魏酸（FA）的高效液相色谱测定法（HPLC），并研究阿魏酸在大鼠体内的药代动力学。方法 用HPLC法，色谱柱为Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm），流动相为：甲醇∶水∶冰乙酸（49∶50.745∶0.255，V/V），流速1.0 mL·min-1，检测波长322 nm。FA用内标（香豆精）法定量。结果 FA的最低检测限为0.25 ng，最低血清检测浓度为5 ng· mL-1（S/N>3），线性范围是26.4～4224 ng·mL-1，r =0.9999.平均加样回收率为98.17％±1.26％.结论 该方法灵敏、快速、简便、专一性和重现性好，可用于阿魏酸血药浓度分析及药代动力学研究。

【关键词】 大川芎丸 阿魏酸 血清 家兔 HPLC

Pharmacokinetics of Ferulic Acid in Rabbit after Administering DACHUANXIONGWAN

Abstract：objective To establish the method for determining ferulic acid in serum by HPLC and study the pharmacokinetics in healthy rabbit after taken DCXW.Methods Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm）was used as the stationary phase，methanol-Water-acetic acid（49∶50.745∶0.255，V/V）was used as mobile phase，flow rate of mobile phase was 1.0 mL·min-1，wavelength of detection was 322 nm.The Coumarin was used as inner standard.Results The detection limit of FA was 0.25 ng，and the lowest detectable concentration of FA was 5 ng·mL-1，with a linearity of 26.4-4224 ng·mL-1，r=0.9999.The mean recovery rate of FA was 98.17％±1.26％.Conclusion This method is sensitive，fast，simple，specific and reproducible.It can be used to the analysis of FA in serum and the study of pharmacokinetics.

Key words:DACHUANXIONGWAN；ferulic acid；serum；rabbit；HPLC

收稿日期 ２００８－０１－３０修回日期 ２００８－０２－２８

基金项目 国家973项目：方剂现代科学研究—方剂作用机理与物质基础的研究，项目编号G1999054402.

作者简介 王 兴(１９７３－ ）男，成都市人，教授，博士后。主要研究方向：中药多靶点药理基因表达差异谱及中药新药研究。E-mail:wshing@263.net大川芎丸出自金·刘完素《宣明论方》卷二，用于治疗“首风，旋晕眩急，外合阳气，风寒相搏，胃膈痰饮，偏正头痛，身拘倦。”是治疗偏头痛的传统方剂。大川芎丸的现代研究始于国家“九五”攻关，对这样一个传统中药复方进行现代化研究，明确它的物质基础和作用机理，已成为“973”国家重点基础发展规划项目之一。该项目前期研究表明，阿魏酸（FA）有明显的抗血小板释放5-HT作用，是方中的主要有效成分［1］。为进行大川芎丸的复方效应成分药动学研究，我们在文献报道的基础上建立了用改良水浴法去除血清蛋白，测定家兔服用大川芎丸后血清中的阿魏酸（FA）的含量，首次成功的研究了家兔服用大川芎丸后体内FA的药代动力学参数。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

惠普公司高效液相色谱（HPLC）系统，Agilent 1100型，VWD紫外检测器；LD4-2型低速离心机，北京医用离心机厂；TGL-16G型台式高速离心机，上海医用分析仪器厂；电热恒温水浴锅；XK96-A型快速混匀器，江苏姜堰市新康仪器厂；GB204型万分之一电子天平，瑞士生产。王兴.健康家兔服用大川芎丸后体内阿魏酸的药代动力学研究

成都医学院学报2008年3月，3(1)

1.2 试药与试剂

阿魏酸对照品（批号：0773-9910），中国药品生物制品检定所提供；香豆精对照品（批号8806615），含量99%，mp68.9℃～70.0℃，购于中国医药公司北京采购供应站；大川芎丸标准提取物１号样（川芎∶天麻＝4∶1，0.867g膏/g生药），由中国中医研究院中药所提供；醋酸、甲醇、冰乙酸均为AR级，水为双重蒸馏水。

1.3 实验动物

健康成年家兔，体重2.3 kg～2.9 kg，雌雄各半；由第四军医大学实验动物中心提供。

1.4 标准溶液的配制

定性用FA标准溶液的配制：用电子天平精密称取4 mg FA标准品，置一10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微量移液器吸取10 μL置于1.5 mL离心管中，用甲醇稀释至1 000 μL，摇匀，即标准液浓度为4 ng·μL-1。制作标准曲线用FA标准溶液及内标香豆精溶液的配制：精密称取FA 6.6 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度为母液1（132 μg·mL-1）。母液1稀释10倍后为母液2（13.2 μg·mL-1），母液2稀释10倍为母液3（1.32 μg·mL-1）。精密称取香豆精5.03 mg于100 mL棕色容量瓶中，加0.3 mL甲醇助溶后用双蒸水稀释至刻度（50.3 μg·mL-1）为母液4.上述配制好的标准溶液密封后置4℃冰箱待用［2］。

1.5 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3（5 μm，4.6×250 mm）；流动相：甲醇∶水∶冰乙酸（49∶50.745∶0.255，V/V）；流速1.0 mL·min-1；检测波长：322 nm；进样量：20 μL.

1.6 样品预处理及测定

用微量移液器精密吸取0.5 mL空白兔血清置于一干净的5 mL 玻璃具塞锥形离心试管中，加入30 μL蒸馏水，再加入100 μL FA（4 ng·μL-1）标准液，加入10 μL香豆精内标液，涡旋混匀15 s，100℃水浴10 min，用超微型搅拌器搅拌1 min制成匀浆，置低速离心机中离心20 min，3 500 r/min，吸取上清液后再加入等量甲醇，涡旋混匀15 s，用氮气流吹干，再加300 μL甲醇复溶，置台式高速离心机中离心5 min，10 000 r/min ，吸取上清液，取20 μL直接进行HPLC测定［3～5］，以峰面积进行定量分析。

2 结果

2.1 方法学研究

在本色谱条件下，阿魏酸、内标香豆精与血清中的杂质峰均作到基线分离，与血清峰无重合，样品峰与杂质峰的分离度＞1.5，见图1.

2.2 血清中阿魏酸标准曲线的制备及其最低血清检测浓度的测定于8支尖底离心试管中分别加入不同的FA标准液，分别精密加入0.5 mL空白兔血清，制成含FA分别为0.00 ng·mL-1、26.4 ng·mL-1、52.8 ng·mL-1、105.6 ng·mL-1、211.2 ng·mL-1、1 056 ng·mL-1、2 112 ng·mL-1、4 224 ng·mL-1的血清标准液，摇匀后按样品预处理项下操作测定（n=6），以FA与内标面积之比对应浓度进行回归，线性范围是26.4～4 224 ng·mL-1，进样量为20 μL.得回归方程［6，7］：Y=1 350.635 X-87.445 7，r=0.999 9，表明在26.4～4 224 ng·mL-1范围内线性关系良好。当S/N>3时，FA检测限为0.25 ng，按照样品预处理方法处理后，测得最低血清检测浓度为5 ng·mL-1。

2.3 回收率与精密度实验

FA 3种浓度按样品预处理项和标准曲线项下处理和测定，以加入已知量为理论值，实际测得面积比代入回归方程中计算值为测定值，二者相比求得相对回收率和日内精密度。取同一批样品，不同天数测定，同法求得日间精密度。

实验结果见表1、表2.表1 FA在血清测定的方法回收率 表2 FA在血清测定的精密度

2.4 阿魏酸在家兔体内药代动力学研究

大川芎丸日服剂量为35 g生药，正常成年人体重按60 kg计算，即0.5833 g生药·kg-1体重，家兔灌胃量为人临床用药量的20倍，即11.667g生药/kg体重。健康成年家兔10只（n=10），雌雄各半，灌胃前禁食不禁水24h，取空白血清，然后按每只体重灌胃大川芎丸标准提取物5号样后于5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300、360 min各取血1 mL，分别离心得血清0.5 mL，这些样品除不加阿魏酸标准液外均同样采用前述样品预处理方法进行样品预处理［8］。进样20 μL.测得家兔服用大川芎丸浸膏后阿魏酸的经时血药浓度，结果见图2.

2.5 数据分析

采用中国药理学会3P97药动学软件，在计算机上进行计算并拟合判别。综合判断，家兔口服大川芎丸标准提取物后体内阿魏酸的分布及代谢属于二室模型。其药动学参数见表3. 表3 家兔服用大川芎丸后阿魏酸药动学参数

3 讨论

3.1 中药药代动力学研究中，多以中药的单体成分进行药代动力学研究，这显然不能代表整个中药方剂的体内过程。中药效应成分动力学是比较适合中药药动学研究的方法，但目前报道的中药复方效应成分动力学研究还较少。作者首次对大川芎丸进行了中药复方效应成分动力学研究，由药动学参数可知，家兔ig大川芎丸后其效应成分阿魏酸自胃肠道吸收非常迅速，分布较快，这为大川芎丸服用后可迅速缓解偏头痛症状提供了依据。

3.2 在药动学方法学研究中，作者采用了改良水浴法。水浴法具有步骤简单、误差小、无毒、费用低廉、高效等特点，但是该方法对色谱柱有很大的损伤，影响色谱柱的寿命。改良水浴法在水浴法的基础上采取N2吹干后甲醇复溶的方法，又可除去大量蛋白沉淀，不仅使色谱图中血清峰的干扰减少，同时也对色谱柱起到了很好的保护作用，使色谱柱的使用寿命延长。

3.3 阿魏酸是大川芎丸中主药川芎的有效成分之一，具有明显的抗血小板释放5-HT作用。但是仅通过阿魏酸的药动学研究还不能完全反映大川芎丸的体内过程，还需对方中的其它有效成分如川芎嗪、天麻素等进行体内变化规律的研究。

【参考文献】 ［1］杨奎，周明眉，姜远平.川芎嗪、阿魏酸对血小板释放5-HT的影响［J］.中药药理与临床，2000，16(增刊): 18. ［2］胡瑞娟，王兴，黄熙.健康家兔服用大川芎丸后血清中阿魏酸的RP-HPLC测定方法［J］.成都中医药大学学报，2003，26（2）：31-33. ［3］黄熙，任平，张莉.HPLC直接测定血清中的阿魏酸—方剂血样预处理新方法（Ⅰ）［J］.中草药，1999，30（3）：175-178. ［4］黄熙，陈可冀，任平.高效液相色谱直接测定沸水浴处理人血清中冠心Ⅱ号来源的阿魏酸［J］.中国中西医结合杂志，1999，19（2）：71-74. ［5］常子军，张莉，黄熙.健康人服用黄芪当归合剂后体内阿魏酸的HPLC法测定［J］. 南京中医药大学学报（自然科学版），2002，18（2）：100-102. ［6］王骊骊，黄熙，任平.反相高效液相色谱法测定冠心Ⅱ号汤剂中芍药甙和阿魏酸的含量［J］.成都中医药大学学报，2001，24（1）：51-52. ［7］常明向，徐莲英，陶建生.阿魏酸纳大鼠体内药物动力学研究［J］.西北药学杂志， 1995，10（2）：81-83. ［8］尚刚伟，黄熙，蒋永培.正常人口服川芎单煎汤剂后体内阿魏酸的药代动力学研究［J］.中药药理与临床，1999，12（6）：38-40.