羧甲基茯苓多糖的制备及抗肿瘤药效学研究

【摘要】 目的 探讨羧甲基茯苓多糖的制备方法及其抗肿瘤活性。方法 在卤代酸存在下一步法简便制备羧甲基茯苓多糖，并分别研究其体内、体外抗肿瘤活性。结果 同对照组相比，羧甲基茯苓多糖在抑制昆明种小鼠H22肝癌细胞及小鼠肿瘤U14 细胞活性方面具有显著效果。结论 通过简便方法制备得到了可显著提高荷瘤小鼠免疫力的羧甲基茯苓多糖，适当剂量的羧甲基茯苓多糖具有良好的抗肿瘤活性。

【关键词】 羧甲基茯苓多糖 制备 抗肿瘤活性

【Abstract】 Objective To study the preparation and the antitumor effects of carboxymethyl pachyman.Methods Carboxymethyl pachmaran was prepared conveniently in onestep process with the presence of halogenated acid. The antitumor effects of carboxymethyl pachmaran in vivo and in vitro were studied respectively.Results There were significant effect of the carboxymethyl pachyman for inhibition on murine 22 hepatocarcinoma cell and murine U14 Cancer Cells comparing with control group.Conclusion Carboxymethyl pachyman can be prepared conveniently. Proper dose of carboxymethyl pachyman has a good antitumor effect. 【Key words】 carboxymethyl pachyman；preparation；antitumor effect

茯苓为常用中药，亦属于壮药的一种，最早见于唐代《新修本草》：“…今调营而理胃，上品仙药也。善能断谷不饥，为药无朽蛀…”(卷十二)［1］，为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，具有健脾利术，宁心安神等功效。茯苓菌核中的β茯苓多糖约占茯苓菌核干重93％，具有多种生理活性［2］，但茯苓多糖不溶于水，不便于临床应用，抗肿瘤活性也不显著。将茯苓多糖羧甲基化可得到具有强抗肿瘤活性的水溶性多糖：羧甲基茯苓多糖(Carboxymethyl pachymaran，简称CMP)，研究发现，羧甲基茯苓多糖能直接抑制肿瘤细胞的生长，显著减轻恶性肿瘤患者化疗、放疗的毒副反应，并且能使患者的免疫功能得到很大程度的改善［3］。本文报道一种较为简便的CMP制备方法，并分别从体内、体外两个角度研究其抗肿瘤活性。

材料与方法 1.材料

（1）实验动物

清洁级ICR/JCL品系小鼠由中科院广州生物医药与健康研究院实验动物中心提供，昆明种小鼠由中山大学实验动物中心提供。

（2）实验药品

羧甲基茯苓多糖由自制白茯苓合成，白茯苓制法：茯苓采至广西百色市乐业县山区，将采集的鲜茯苓经去杂去沙→分等→发汗→剥皮→切制(白、赤分开)→日晒至六成干→回润→日晒或烘至全干等工艺制得。二氯乙酸、异丙醇、氢氧化钠等均为分析纯，购自上海化学试剂公司。

（3）主要仪器 干燥箱，分析天平，100目筛；Thermo Forma 3110二氧化碳培养箱，2010型酶标仪（ELISA Reader 2010），SCWCJ超净工作台，CK4032NFL荧光倒置显微镜等。

2.方法

（1）羧甲基茯苓多糖的简便制备

取自制白茯苓（去皮茯苓菌核）进一步烘干（95℃左右），粉碎，过100目筛备用；称取上述制备的25 g茯苓粉，加入至100 ml异丙醇溶剂中，加入1%氢氧化钠溶液50 ml，搅拌使碱液溶解后，在快速搅拌条件下，通过真空滴液漏斗滴入二氯乙酸的异丙醇溶液(1∶1.2，50 ml)，控制温度在50℃搅拌反应3.5小时。反应结束后将上层异丙醇倾出并回收利用，下层加入5%盐酸溶液，快速搅拌下加入乙醇50 ml， 过滤，固体物部分溶解于水中，用乙醇沉淀，过滤，干燥，得白色粉末状固体，即羧甲基茯苓多糖。波谱数据：羧甲基茯苓多糖：1H NMR(400 MHz)δ:3.3 (s， 质子堆积峰);IR (CH2Cl2): 1582（─COO-吸收峰），1345（─CH2─峰），885（弱β吡喃吸收峰）cm-1。 配制8 mg/ml羧甲基茯苓多糖待用。

（2）体内抗肿瘤实验

CMP溶液抑制小鼠肿瘤U14实验：先将48只20 g ICR/JCL品系小鼠右前肢液部用碘酒、酒精作表面消毒，然后将0.3 ml的小鼠U14 腹水型瘤细胞毒（3.3×106个）注射入皮下，接种后饲养7天，逐只检查小鼠接种部位的瘤细胞生长情况，选出可以触摸到肿块的小鼠，随即分成6组，每组8只。从第八天起，实验组小鼠每天分别按30，60，120，180，240，360 mg/kg等6种不同剂量腹腔注射给药1次，对照组每只小鼠每天腹腔注射等体积生理盐水一次，各组连续给药10天，停药后再继续饲养7天，然后将各组小鼠颈椎脱臼处死，直到完整剥离出瘤体，称重，计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组瘤体称重-CMP组瘤体称重）÷对照组瘤体称重×100%。

CMP溶液抑制昆明种的小鼠H22肝癌细胞实验：5个实验组（每组均90 ml）的细胞培养液中分别预加入CMP 20 μg，40 μg，200 μg，500 μg和1 mg，对照组的细胞培养液（90 ml）不加入CMP。取接种7天生长良好的腹水型带H22肝癌的小鼠，颈椎脱臼处死，取腹水，用生理盐水稀释成每毫升1×106个癌细胞的悬液，然后在实验组、对照组的细胞培养液中分别加入10 ml癌细胞悬液(每毫升含1×106个癌细胞)，各组混匀，于37℃共培养24小时，采用MTT法观察CMP对小鼠H22肝癌细胞生长的影响。OD值由下述公式计算：OD=C×D×E= 1og(1/T)，C为检测物的浓度，D为检测物的厚度，E为摩尔因子，T为检测物的透光值。 3.统计学处理

计量资料以-±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为有统计学差异。

结 果

1.体内抗肿瘤作用

实验结果表明，CMP30～360 mg/kg剂量腹腔注射，对ICR/JCL品系的小鼠肿瘤U14 有较强的抑制作用，对比实验发现CMP最优注射剂量为180 mg/kg。见表1。表1 CMP腹腔注射对小鼠肿瘤U14 的抑制作用(略)注：与对照组比较，▲P＜0.01 2.体外抗肿瘤作用 体外实验研究表明，0.2～10μg/ml浓度的CMP对小鼠H22肝癌细胞的生长有较显著抑制作用，其中以CMP 2.0 μg/ml为最优浓度。见表2。表2 CMP对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用(略)注：与对照组比较，▲P＜0.01

讨 论

1.羧甲基茯苓多糖的制备

羧甲基茯苓多糖的制备方法主要有水媒法和溶媒法两种［4］。水媒法是把初步制得的茯苓多糖用稀碱溶液溶解，再加入一定量的卤代酸水溶液，适当温度下进行醚化反应；溶媒法则是把茯苓多糖悬浮在有机溶剂(如二甲苯、氯仿、乙醇等)中，碱化一段时间，再加入卤代酸，在适当温度下进行醚化反应，使卤代酸中-CH2COOH结构取代多糖分子上的OH中的H，取代程度越高，羧甲基茯苓多糖收率也越高。第一种方法加酸中和后，多糖在介质中呈黏稠的凝胨状，分离难度很大，使CMP分离产率显著降低；第二种方法有机溶剂消耗量大，成本高。本研究选用自制茯苓粉在异丙醇溶剂中高效合成羧甲基茯苓多糖，并通过工艺优化试验，使其消耗水和有机溶剂尽可能少，反应操作简便，羧甲基取代度高，产品水溶性好，临床应用效果显著。

2.抗肿瘤实验

癌症为世界医学极为关注的难题，世界各国均高度重视，各种治疗、预防措施正加紧研究。茯苓具有特有的药理、药化作用，其抗肿瘤效应亦日趋引起人们的重视。由于茯苓多糖分子中主要为β－1→6葡萄糖结构，糖链上分布有少量的β－1→6结构的葡萄糖侧链。未经化学改造的茯苓多糖对肿瘤的抑制率仅为 0～3％。本实验采用化学修饰方法将茯苓多糖中的β－1→6侧链切断，经过适度水解得到线型的β－1→3茯苓次多糖，在卤代酸存在下将其羧甲基化，即可得到有较高抗肿瘤活性的羧甲基茯苓多糖。 体内实验结果表明，CMP 30～360 mg/kg剂量腹腔注射，对ICR/JCL品系的小鼠肿瘤U14有较强的抑制作用，当注射剂量为30 mg/kg时，抑瘤率为68.7%，随着剂量的增大，抑瘤率逐渐升高，当注射剂量为60 mg/kg时，抑瘤率升至77.2%，而注射剂量升至180 mg/kg时，抑瘤率可高达92.2%。但注射剂量再进一步升高对提高抑瘤率并无帮助，相反，随着注射剂量加大，抑瘤率有一定程度降低，如当注射剂量为360 mg/kg时，抑瘤率反倒下降为89.1%。因此，本抑瘤实验中，CMP最优注射剂量应为180 mg/kg。体外实验研究表明，0.2～10 μg/ml浓度的CMP对小鼠H22肝癌细胞的生长有较显著抑制作用。如当CMP浓度为0.4 μg/ml时，12小时和24小时OD值分别为0.8212±0.081 和1.473±0.081，较对照组显著降低（P均＜0.01），CMP 2.0 μg/ml为最优浓度，浓度更高将导致OD值进一步升高。