关于外排泵msrA在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用

【摘要】 目的：探讨外排泵msrA在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用. 方法：从野生菌株中克隆msrA基因全长，并通过穿梭载体pBT2电转化至限制缺陷菌株金黄色葡萄球菌RN4220，提取质粒后再转化S.epidermidis 1457（ica+， 产膜阳性菌），得到S. epidermidis 1457msrA. 实时荧光RTPCR检测S. epidermidis 1457msrA和野生株S68浮游菌、生物被膜内细菌红霉素作用24 h前后msrA mRNA的表达. 结果：表葡膜内菌msrA的表达在红霉素（10倍MIC）作用前后未见统计学差异. 结论：提示膜内菌对红霉素耐药性的增加可能与外排泵基因的上调无关. 【关键词】 表皮葡萄球菌 物被膜 红霉素 耐药性 0 引言 表皮葡萄球菌（简称表葡菌）引发的医院感染已得到人们的日益关注，虽然表葡菌分泌的毒性因子较金黄色葡萄球菌少，但其粘附在多聚材料上，形成生物被膜而引发的感染却呈现慢性、持续性、反复性和难治性的特点［1］. 生物被膜的产生使膜内菌对抗生素的耐药性比浮游菌增加10～1000倍， 其引发的感染常常只有移走植入物才能控制［2］，但其对抗生素的耐药机制目前还不十分清楚. 外排泵msrA是浮游葡萄球菌对MLSB类抗生素耐药的主要机制之一， 我们探讨外msrA在生物被膜内细菌对红霉素耐药性中的作用如下： 1 材料和方法 1．1 限制缺陷型菌株 Staphylococcus aureus RN4220，Staphylococcus epidermidis 1457(产生物被膜， ica+， 红霉素MIC 0.25 mg/L)和穿梭载体pBT2由美国Micheal Otto教授惠赠；野生株S68（产生物被膜，msrA+， 红霉素耐药MIC 32 mg/L）. 根据msrA全长（GenBank No.X52085），设计引物并在两端加SalⅠ和BamHⅠ酶切位点（F 5′ AAAAGTACT gat ctt tgt act tag aga tat3′；R 5′ CGGGATCC gat cgg tta tgg tac tat tg3′），以菌株S68为模板扩增msrA， PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 1 min，46℃ 1 min，72℃ 90 s，32个循环后，72℃ 7 min. PCR产物凝胶纯化后，连于pMD18T载体并测序验证. 将pMD18TmsrA质粒和pBT2质粒用SalⅠ和BamHⅠ双酶切后，将长度为2.0 kb的msrA片段和6.9 kb的pBT2质粒DNA片段连接后，转化入E. coli DH5α感受态细胞，用含Amp（100 mg/L）和Em（20 mg/L）的LB琼脂平板筛选，挑选菌落增菌提取质粒后，用SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定；同时PCR扩增msrA鉴定. DL2000 DNA maker， Taq酶（DRR001A）和PCR试剂均购自TaKaRa公司. 1.2.1 S. epidermidis 1457pBT2/msrA株的构建 取S. epidermidis 1457新鲜增菌液1 mL接种于25 mL B medium（含蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖1 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾1 g/L） 37℃震荡培养至A600 nm 0.8. 收集细菌用灭菌三蒸水和100 mL/L甘油溶液洗涤后，用800 μL甘油(100 mL/L)溶液悬起，以每管70 μL分装于灭菌Eppendorf管，-70℃保存. 取-70℃保存的金黄色葡萄球菌RN4220感受态细胞于室温融化. 每管加入重组质粒pBT2+msrA 6 μL（100 mg/L），轻轻混匀，室温放置30 min，将细菌转入0.2 cm电转杯，电击1次（电压2 kV，电容25 μF，电阻100 Ω），通电时间约为2.4 ms. 迅速加入0.9 mL B medium悬起细菌， 37℃震荡培养3 h，取100 μL涂于含 Cm （20 mg/L）的B medium琼脂平板，37℃倒置培养24 h后，挑取克隆，接种到5 mL含抗生素的LB液体培养基中，振摇培养12～16 h，用Qiagen质粒抽提试剂盒提取质粒，SalⅠ和BamHⅠ酶切鉴定. 采用Qiagen plasmid midi kit从金黄色葡萄球菌RN4220中提取50～100 μg质粒，按上述方法电转化S. epidermidis 1457感受态细胞，用含Cm （10 mg/L）和Em（10 mg/L）的B medium琼脂平板筛选阳性克隆. 1.2.2 S. epidermidis 1457msrA的鉴定 提取质粒用SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定. 提取基因组DNA，PCR鉴定: msrA（1887 bp）引物同前和 icaA（814 bp）引物为：5′GACCTCGAAGTCAATAGAGGT3′，5′CCCAGTATAACGTTGGATACC3′. 95℃变性5 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环后，72℃延伸7 min；肉汤稀释法测量S. epidermidis 1457和S. epidermidis 1457msrA菌株的红霉素最小抑菌浓度， 按常规方法操作，标准菌株Staphylococcus epidermidis ATCC12228; 采用KB纸片琼脂扩散法检测S. epidermidis 1457和S. epidermidis 1457msrA株对氨苄西林、苯唑西林、四环素、环丙沙星、庆大霉素、氯霉素的药物敏感性，根据抑菌环直径的大小按NCCLS（2005）标准判读. 将S. epidermidi 1457和S. epidermidis 1457msrA株接种于刚果红 ［3］ 培养板，检测其产膜特性. 1.2.3 细菌生物被膜的形成［4］和实时定量RTPCR 将新鲜增菌液稀释至光密度为0.2（600 nm），取5 μL接种于已置于B medium平板上的0.2 μm聚碳酸酯微孔滤膜上（直径约25 mm），35℃孵育48 h，滤膜及所生成的生物被膜每隔12 h转移到新的平板上. 聚碳酸酯微孔滤膜（Whatman Inc，USA）购于联星生物有限公司，使用前121℃高压15 min. 生物被膜形成后转移至含红霉素的B medium平板上（10倍MIC），并在红霉素作用24 h前后取样，放入细菌RNA保护液（Qiagen）中， 尽快提取总RNA. 将S. epidermidis 1457msrA和S68菌株增菌24 h后的浮游菌和生物被膜红霉素作用前后样品，用Qiagen RNeasy mini kit提取总RNA. 使用RNasefree DNase set （Qiagen）去除样品中的基因组污染. 采用Takara SYBR ExScriptTM RTPCR Kit进行实时定量PCR检测浮游菌，膜内菌红霉素作用前后msrA基因的表达，以16S rRNA为内对照. 采用DNAstar设计引物为：msrA 5′ AAGCCAGTAAAGCTAAACGAAATC 3′，5′ TTTTGATGCACTTAAACGATCTGG 3′；16S rRNA 5′ CCATGTGTAGCGGTGAAATGC 3′，5′ ACATCAGCGTCAGTTACAGACC 3′. 使用1457msrA浮游菌总RNA样品转录成cDNA梯度稀释为100， 10， 1， 0.1， 0.01 ng/L作为标准品，进行Real Time PCR反应，制作16sRNA标准曲线和cDNA梯度稀释为100， 10， 1， 0.1， 0.01 μg/L作为标准品，制作目的基因的标准曲线. 检测各标本Ct值，根据标准曲线计算样品目的基因的浓度，分别用16S rRNA和1457浮游菌各目的基因表达量进行校准获得相对表达量. 使用没有逆转录的反应作为对照鉴别是否有基因组污染. 操作时每份样品重复3次. 统计学处理：数据用x±s表示，采用CHISS 2004统计软件组内前后比较采用配对t检验，组间比较采用t(t′)检验. 2 结果 2．1 重组质粒pBT2msrA电转入S.epidermidis 1457 全长msrA（1887 bp）从野生菌株S68中扩增后，克隆入pMD18T，测序验证其序列的正确性；将序列正确的msrA克隆入pBT2（6970 bp)载体，筛选出的阳性克隆质粒经SalⅠ和BamHⅠ双酶切，分别得到6970 bp和1887 bp的DNA片段，证明pBT2msrA重组质粒构建成功（图1）. 首先将重组质粒电转化入金黄色葡萄球菌RN4220，经SalⅠ和BamHⅠ双酶切，0.8 g/L琼脂糖电泳证明正确后，从RN4220中抽提高浓度的质粒电转入S.epidermidis 1457，经抽提质粒酶切、电泳证明分别为6970 bp和1887 bp片段（图2）. KB纸片琼脂扩散法检测其对氨苄西林、苯唑西林、四环素、环丙沙星、庆大霉素、氯霉素药物均敏感，与S.epidermidis 1457相同；对红霉素耐药，最小抑菌浓度为16 mg/mL； msrA（1887 bp）和icaA PCR（814 bp）扩增阳性（图3）；刚果红培养均产黑色带干结晶体菌落. 2.2 实时荧光定量RTPCR 表葡菌1457msrA和野生株S68膜内菌红霉素作用前后msrA表达未见统计学差异（P>0.05， 表1）.表1 实时荧光定量RTPCR检测表葡菌1457和S68 msrA表达水平aP<0.05 vs膜内菌EM作用前.

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